Western成像的iBright FL1500 Universal Mode方案

       Western Blot實(shí)驗(yàn)流程中，SDS-PAGE凝膠和免染膠、凝膠與Blot、ECL Blot與熒光Blot之間檢測(cè)成像原理和方法不盡相同。

       凝膠無論用麗春紅S、考馬斯亮藍(lán)染色，通常要用紫外-白光轉(zhuǎn)換屏（疊放于紫外透射臺(tái)上組合使用，將紫外線轉(zhuǎn)換為白光）或LED白光板（自帶電源接口，發(fā)光效率高、照明均勻，對(duì)低豐度條帶分辨靈敏度高），白光從凝膠底部透射進(jìn)行成像。凝膠覆蓋區(qū)透射白光會(huì)因凝膠和樣品吸收和散射作用，亮度減弱。但在凝膠覆蓋區(qū)外，白光直射進(jìn)入成像單元。若曝光時(shí)間較長(zhǎng)，極易因CCD像元電子阱容量飽和而發(fā)生光電子外溢、污染圖像成像區(qū)，使圖像失去定量分析價(jià)值。不僅透射光如此，采用反射白光檢測(cè)應(yīng)用中，若樣品反射白光過強(qiáng)，同樣會(huì)出現(xiàn)圖像局部過度曝光現(xiàn)象。為此，iBright FL1500預(yù)裝有針對(duì)400-700 nm波長(zhǎng)可見光的中性密度濾光片(Neutral density filter, ND filter)，以降低LED反射光強(qiáng)度，避免反射光成像過曝風(fēng)險(xiǎn)。

       蛋白印跡ECL檢測(cè)須排除一切外來光源干擾。這使得蛋白凝膠、蛋白Blot成像的操作互不兼容，無法同時(shí)進(jìn)行。因此，以印跡微弱光信號(hào)檢測(cè)為首務(wù)的Western成像系統(tǒng)，白光屏或白光板均非必備附件。可喜的是，iBright FL1500的標(biāo)配附件含有LED白光板！

除去亮考、銀染這類非特異性染色法，用SYPRO Ruby蛋白凝膠染色劑、No-Stain免染蛋白熒光標(biāo)記試劑處理凝膠的成像分析，也是樣品總蛋白定量的常用手段。

       SYPRO Ruby熒光成像，既可用伯樂ChemiDoc MP、ChemiScope 6200這類標(biāo)配302nm紫外透射光源的Western 成像儀進(jìn)行，也可以依托iBright FL1500、iBright CL750和iBright CL1500（包括iBright CL1000）配備的488nm LED透射光源完成。為防止白光干擾熒光信號(hào)采集，凝膠樣品的熒光檢測(cè)和凝膠透射、反射白光分析也不可同時(shí)實(shí)施。                                              

       正是Western Blot實(shí)驗(yàn)流程中凝膠和印跡樣品，透射與反射光運(yùn)用、熒光與發(fā)光等不同檢測(cè)方法之間的相互沖突，催生了多功能智能化Western成像系統(tǒng)。

1、iBright FL1000代表的Western多模式成像解決方案

       iBright FL1000是invitrogen iBright FL1500的上一代產(chǎn)品，2017年上市。

       為解決Western Blot多步驟、多種標(biāo)記成像需求，iBright FL1000系統(tǒng)開發(fā)了4種成像模式。

表1.  iBright FL1000系統(tǒng)四種成像模式

       新手上機(jī)，只需根據(jù)測(cè)試樣品選擇一種成像模式，并確定白光板的取舍、完成樣品的擺放，余下的操作，從照明的開啟，激發(fā)和檢測(cè)濾光片的配置實(shí)用、樣品的自動(dòng)聚焦、曝光時(shí)間的掌控，全部由系統(tǒng)智能管理。

       如選擇［Fluorescent blot］進(jìn)行單色或多色熒光成像，只需幾步簡(jiǎn)單操作：

       1）點(diǎn)擊染料通道dye channel鍵，調(diào)出可選染料列表；

表2 iBright FL1000系統(tǒng)熒光檢測(cè)通道

       2）從列表中選擇二抗的標(biāo)記染料對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道(EX3和EX4為二選一)；

       3）為染料選一種色彩(系統(tǒng)將把不同染料標(biāo)記的條帶以偽彩色效果顯示和區(qū)分)、設(shè)定曝光時(shí)間；

       4）確認(rèn)完成一個(gè)熒光檢測(cè)通道的成像條件設(shè)置；

       5）重復(fù)上述4步操作，直至完成其余熒光通道的設(shè)置；

       6）點(diǎn)擊［Capture］啟動(dòng)圖像的采集協(xié)議。

       討論iBright FL1000系統(tǒng)的［Fluorescent blot］成像模式，是因?yàn)檫@個(gè)模塊具有其它三種應(yīng)用模式所不具備的一個(gè)圖像處理功能——多通道圖像疊加功能。

       在熒光Blot成像模式下，系統(tǒng)首先通過不同顏色檢測(cè)通道分別采集相應(yīng)波長(zhǎng)熒光的圖像，所有圖像采集完成后，以2UP（Universal Mode Preview, UP）圖像預(yù)覽界面顯示全部圖像：預(yù)覽區(qū)上部顯示所有檢測(cè)通道獲取的黑白圖像，預(yù)覽區(qū)下部是將同一塊Blot上在不同熒光通道獨(dú)立采集、分別添加了選定的偽彩色后的由多個(gè)通道圖像疊加產(chǎn)生的渲染圖，便于研究者直觀檢視、對(duì)比各靶蛋白條帶的信號(hào)。

       熒光Blot模式下多通道圖像疊加功能，在ECL印跡檢測(cè)中不適用。但Western實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)表、匯報(bào)時(shí)，提供Marker、TPN方法驗(yàn)證的圖片證據(jù)，無疑使數(shù)據(jù)和分析結(jié)果更詳實(shí)可信。譬如，將蛋白分子Marker序列圖像、ECL檢測(cè)法或多色熒光標(biāo)記檢測(cè)的靶蛋白條帶圖像和（或）連同熒光方法總蛋白檢測(cè)圖像合并疊加到同一張圖片上。因此，iBright FL1000雖滿足了Western Blot實(shí)驗(yàn)多個(gè)環(huán)節(jié)、多方法成像功能的需求，但無法將同一Blot不同成像模式下獲取的圖像整合，沒有解決蛋白Blot樣品分析過程重要圖像信息的碎片化問題。

       因此，iBright FL1000成像系統(tǒng)盡管實(shí)現(xiàn)了多種應(yīng)用模式智能化控制，使用中還依然存在不便。首先，相較于常規(guī)蛋白凝膠染色圖像，大量發(fā)表的蛋白Blot圖像中，只見靶蛋白條帶缺少分子量Marker序列條帶驗(yàn)證信息。其次，部分實(shí)驗(yàn)人員反映，采集的蛋白Blot圖像中，分子量Marker條帶與靶蛋白顏色深淺相反、不一致。這些Western成像和分析中的經(jīng)典煩惱，隨著iBright FL1500系統(tǒng)Universal Mode的應(yīng)用而得到了完美解決。 

2、Universal Mode的Western成像解決方案

       iBright FL1500的Universal Mode（通用模式），官方定義為：

       Custom Mode to image samples containing one or more signal types, such as chemiluminescence, fluorescence, colorimetric stains, and/or visible images; image display is similar to fluorescent blot mode and allows one to assign false color to any sample.

       就是說，這種自定義成像模式，能對(duì)包含有一種或多種信號(hào)類型（化學(xué)、熒光和/或可見光）的同一個(gè)樣品別按設(shè)定的成像模式、光學(xué)通道和工作先后順序完成多中模式圖像的采集，并自動(dòng)將這些各自獨(dú)立的圖像疊加成一張圖，再加上漂亮的偽彩色渲染后呈現(xiàn)。而所有原始圖像和疊加圖像均可保存和輸出。

       通用成像模式適用于iBright FL1500與iBright CL1500，但iBright CL750除外。

       討論iBright FL1500通用成像模式前，首先明確2個(gè)基本概念。

       第一，無論蛋白凝膠考染、蛋白Blot麗春紅S染色，CCD曝光所采集的光學(xué)信號(hào)均非樣品本身發(fā)射，是入射白光接觸樣品時(shí)被吸收、散射或反射后的結(jié)果。從條帶區(qū)始發(fā)進(jìn)入CCD的信號(hào)要弱于從條帶毗鄰區(qū)背景始發(fā)的信號(hào)，使CCD輸出的是黑帶白底圖像。而蛋白凝膠或印跡，無論ECL或熒光標(biāo)記、檢測(cè)光源是透射抑或反射，CCD成像信號(hào)都源于樣品自身發(fā)射，樣品豐度越高，發(fā)光基團(tuán)量子效率越高，則CCD輸出的亮帶暗底圖像上條帶越發(fā)明亮。

       第二，Western成像系統(tǒng)采集的圖像，與經(jīng)實(shí)驗(yàn)人員處理后用于發(fā)文匯報(bào)所用圖像，本質(zhì)等效而條帶-背景黑白對(duì)比呈現(xiàn)效果相反（具體原因，參考《光密度值和灰度值如何在Western Blot條帶定量和凝膠圖像分析中應(yīng)用? 》）。不管marker、總蛋白、靶蛋白和管家蛋白條帶的成像機(jī)制如何，習(xí)慣上最終都要人為地“歸一化”轉(zhuǎn)為黑條帶白背景的發(fā)表圖片效果。

       iBright FL1500通用成像模式將熒光、發(fā)光、反射/透射白光這些互不兼容的檢測(cè)程序融為一體，達(dá)到井水不犯河水般和諧，靠的是對(duì)應(yīng)用的時(shí)序管理。本質(zhì)是讓實(shí)驗(yàn)人員綜合權(quán)衡靶蛋白檢測(cè)方法、分子量Marker類型和條帶信號(hào)強(qiáng)度歸一化方法后，依托系統(tǒng)個(gè)智能化檢測(cè)通道成像控制功能，把對(duì)系統(tǒng)資源利用存在沖突的成像任務(wù)按信號(hào)檢測(cè)的緊迫程度進(jìn)行排隊(duì)后，由成像系統(tǒng)動(dòng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)協(xié)議。通用成像模式DIY編程模塊，實(shí)現(xiàn)了蛋白Blot成像過程一鍵完成。

       我們以Western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中磷酸化p-AKT水平檢測(cè)為例，了解一下通用成像模式的操作流程。實(shí)驗(yàn)中以IGF-1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的AKT磷酸化，采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè) (SuperSignal West Femto)。No-Stain 蛋白標(biāo)記試劑標(biāo)記所有條帶總蛋白（用于執(zhí)行TPN處理）。分子量Marker用的是iBright prestained marker (化學(xué)發(fā)光檢測(cè))。完成二抗孵育后在iBright FL1500上采用通用成像模式檢測(cè)。

檢測(cè)協(xié)議的主要設(shè)定步驟包括：

       ① 選通用成像模式

       ② 選Chemi blots通道下SuperSignal West Femto底物（化學(xué)發(fā)光法完成(AKT、marker檢測(cè)）

       ③ 選擇TPN No-Stain通道下的No-Stain Labeled Membrane應(yīng)用（熒光通道完成總蛋白檢測(cè)）

       ④ 確定點(diǎn)擊圖像捕獲按鈕

       在通用成像模式下，系統(tǒng)將按設(shè)定的順序分階段完成所有檢測(cè)通道的圖像采集。

       在2UP圖像預(yù)覽界面，系統(tǒng)將不同檢測(cè)通道下獲取的帶marker的AKT化學(xué)發(fā)光原圖、總蛋白熒光原和兩個(gè)檢測(cè)通道圖像疊加后的圖像分別顯示。

3、小結(jié)

       通常，在核酸、蛋白凝膠圖像中，分子量Marker序列條帶是座上客（占據(jù)左側(cè)第一泳道位置），用于指示目標(biāo)條帶的分子量范圍。Western Blot實(shí)驗(yàn)按理也應(yīng)遵守同樣的報(bào)告規(guī)則，但實(shí)際執(zhí)行情況并非如此，主要是兩方面的原因造成的。
       商品化的蛋白分子Marker，無論是用戶自染型、出廠預(yù)染型、Stain-free免染型、熒光標(biāo)記型，還是化學(xué)發(fā)光標(biāo)記型，marker都具有清晰的條帶外形、適宜的條帶亮度和穩(wěn)定的批次重復(fù)性。即便Marker與條帶都用ECL發(fā)光標(biāo)記、在同一Blot上同步添加底物和上機(jī)檢測(cè)，目標(biāo)蛋白條帶，特別是低表達(dá)靶蛋白，也難以企及marker捷足先登的優(yōu)秀表現(xiàn)。當(dāng)Marker和高表達(dá)蛋白條帶信號(hào)進(jìn)入系統(tǒng)的線性檢測(cè)范圍，甚至要過曝超出系統(tǒng)線性范圍極限了，都不見弱信號(hào)條帶現(xiàn)身。因此，實(shí)驗(yàn)中常進(jìn)行裁膜，將靶蛋白泳道與marker條帶分開，單獨(dú)孵育和上機(jī)檢測(cè)。不同Blot膜條轉(zhuǎn)移效率存在誤差、上樣時(shí)擺放位置和對(duì)齊角度的偏差、系統(tǒng)自動(dòng)曝光控制下曝光時(shí)間的差異等，使同一Blot實(shí)驗(yàn)生成最終報(bào)告圖片，不是一張完整的mini膜，而是若干獨(dú)立小裁條的拼圖，蛋白條帶信號(hào)強(qiáng)弱、條帶位置和形狀及圖像背景表現(xiàn)各異。而常規(guī)成像控制軟件的圖片合并功能模塊又難以有效適應(yīng)蛋白Blot圖像整合的要求。這就造成了Western 蛋白印跡報(bào)告圖中的種種“合理”現(xiàn)狀。
       Invitrogen為iBright成像分析儀開發(fā)的Universal Mode通用成像控制模式，通過軟件對(duì)不同檢測(cè)光學(xué)通道成像的時(shí)序管理、成像區(qū)域的設(shè)置，可對(duì)同一個(gè)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行多輪次、多方法、多目標(biāo)和多圖片采集（可以分批次上樣和成像），并能對(duì)控制協(xié)議下全部Western Blot實(shí)驗(yàn)要素的圖像提供整合、疊加顯示功能，為研究人員帶來美輪美奐、絢麗多彩的WB夢(mèng)幻之圖。
       通用成像控制模式實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白印跡各要素、熒光、發(fā)光、可見光成像等多種檢測(cè)方法在同一塊Blot上的全覆蓋、大融合，又具有各獨(dú)立成像控制模式的圖像分析功能。Universal Mode只適用于iBright FL1500、iBright CL1500兩個(gè)型號(hào)。

參考文獻(xiàn)：

［1］iBright CL1500 Imaging System and the iBright FL1500 Imaging System USER GUIDE Rev B.0

［2］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)