一、Western Blot條帶定量分析引入TPN方法的必要性

      Western Blot實驗操作的多個步驟都可能存在誤差，如樣品稀釋濃度和上樣移液體積誤差，蛋白轉膜效率差異等。為使蛋白印跡條帶間的信號強度差異，能準確反映出樣品間的蛋白質表達水平差異，需要對Blot各泳道中條帶的有效信號強度值進行歸一化（Normalization）處理。歸一化處理通常是三步進行。首先，對每個泳道所有蛋白條帶做扣除背景操作獲得各條帶的有效信號強度值。第二步，從印跡上選擇一個參考泳道（通常是第一個樣品泳道，也可以是人為認定的其他泳道)，以參考通道的內參蛋白信號強度為基準，將其與其他泳道的內參有效信號值相除，得出每個泳道的歸一化因子（normalization factor）。最后，將靶蛋白條帶有效信號值乘以歸一化因子，得到條帶信號強度的歸一化數值，以此歸一化值作為蛋白表達豐度統計分析的依據。

      Western Blot實驗常用內參蛋白有兩種。一種是存在于所有樣品中、且其表達較穩定的管家蛋白（Housekeeping protein, HKP）。另一種是印跡中各泳道的總蛋白。無論選誰做內參，都需滿足兩個條件：

      1）內參的表達須不受組織來源、實驗處理方法的影響；

      2）電轉印完成后，靶蛋白、內參蛋白的信號強度均應處于各自的檢測線性動態范圍內（即檢測信號強度隨蛋白質上樣量增加而成比例增加）。

      不少研究已觀察到：管家蛋白在不同組織來源表達量不同，經不同實驗干預處理后表達也不相同。內參蛋白通常表達量較高，但上樣量—條帶信號強度線性關系表現不佳。而通常靶蛋白的表達較低，當加大靶蛋白上樣量時，高表達的管家蛋白易出現過載，信號強度超出其定量線性范圍的情形。因此，未經驗證地將β-肌動蛋白（β-actin）、甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、α-微管蛋白(α-tubulin)和次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1 (HPRT1)等管家蛋白用作Western Blot內參，從流程到方法都是錯誤的。                                              

      而總蛋白歸一化(Total Protein Normalization, TPN)方法則克服了管家蛋白歸一化方法的諸多缺點。

      TPN是指Blot的單個泳道內所有蛋白條帶的總信號值扣除背景后的總有效值確定為該泳道內蛋白總上樣量、將此信號值與參考泳道相應指標來相除結果作為該泳道所有蛋白條帶信號強度的歸一化因子的方法。

      所有條帶總蛋白作為內參蛋白，不易受實驗處理方法、組織細胞來源的影響，而最重要的是，大多數總蛋白的線性動態范圍能與低表達靶蛋白的線性范圍匹配。研究表明，在 10–50μg常規上樣量范圍，總蛋白Blot信號值均表現出良好線性特征，不易出現信號過飽現象，可真實地反映該泳道的總蛋白上樣量。因此，TPN方法可用于大多數蛋白Blot條帶的定量分析。

      目前，部分學術期刊要求嚴格遵守使用內參的標準，使用可產生線性動態范圍的成像技術。而越來越多的研究者在發文中Western實驗中使用了TPN方法。

二、iBright FL1500 Western熒光成像分析儀適用的TPN技術方案

      電轉印結束后，首先要確認全部蛋白質被正確轉移到膜上，以便及時發現印跡中任何空泡和轉印不均等異常情形，改進存在的問題電泳和電轉實驗步驟重新實驗。而對Blot各泳道蛋白條帶的可視化處理，既是Blot驗證的需要，同時也是在為進行TPN處理做成像準備。

      驗證蛋白Blot的一種常見做法是印跡的麗春紅S (Ponceau S)染色（染色的Blot經沖洗后可繼續執行印跡免疫檢測）。染色過程耗時約20分鐘不算長，但麗春紅S與蛋白質結合持續時間短，須迅速完成圖像采集，否則染色條帶逐漸褪色后條帶信號強度降低，使總蛋白的定量失準。操作時間限制，這僅是麗春紅S染色法的技術缺陷而已。

      在我們看來，麗春紅S染色法用于蛋白Blot條帶總蛋白定量，方法的選擇上就不妥。它本不應該被如此高調、理所當然地用于蛋白Blot的定量分析（注：SDS-PAGE凝膠定量例外）。

      PubMed收錄期刊發文中，采用NIH ImageJ Software（也叫Fiji）進行Western Blot圖像分析的文章數以萬計。ImageJ使用指南中關于朗珀-比爾定律在圖像定量分析應用的說明，想必知悉詳情的研究人員不在少數。對于蛋白Blot條帶這類樣品圖像信號值與樣品測試成份含量關聯問題，指南指出，不透明樣品用反射光源照明生成的圖像，因樣品表面對光源散射、反射，使得這部分來自光源的信號連同圖像有效信號一同被采集形成分析圖像，其圖像信號強度并不能代表待測樣品有效含量。因此，對于蛋白Blot用反射白光照射生成的染色圖像來定量總蛋白，不符合朗珀-比爾定律，定量結果準確性就更值得商榷。

      根據ImageJ指南說明，蛋白Blot這類樣品檢測，應該是基于樣品本身發射的熒光、化學發光（生物發光）信號形成的圖像進行定量分析。故采用ECL發光、熒光染料標記所獲取的蛋白Blot圖像作為蛋白定量依據，可謂是恰得其所。

       可用于蛋白Blot熒光標記染料，如SYPRO Ruby（SYPRO寶石紅）等，不僅相對昂貴，還需固定、隔夜染色和脫色一系列精細操作處理，其過程耗時而繁瑣。

      反觀伯樂Stain-Free免染凝膠、Invitrogen No-Stain 免染型蛋白染色試劑代表的新型免染成像技術，不僅與下游免疫印跡檢測流程完全兼容，可在短短2分鐘內完成蛋白質轉印效率的驗證，而且條帶熒光信號強度不受染色或脫色操作時間影響，信號穩定。這極大加快、簡化Western Blot條帶可視化和總蛋白定量過程。

      那iBright FL1500系統是否支持所有免染蛋白熒光成像技術方法？回答是：不全部支持。

       伯樂Stain-Free免染膠蛋白熒光成像技術的核心是在手灌SDS-PAGE凝膠或商品化預制膠中添加了一種三鹵化合物。該化合物與蛋白質分子中的色氨酸殘基共價結合，不干擾電泳或轉膜實驗。三鹵化合物自身不產生熒光，而它與蛋白質共價復合物經302nm紫外激發能產生熒光，且熒光信號持續貫穿于凝膠電泳及轉膜全過程，便于成像分析。

      而iBright FL1500配置缺少必要的反射式UV激發光（標配LED綠色透射光激發光源不適用），無法激發伯樂的Stain-Free免染凝膠完成TPN分析，故只能使用Invitrogen No-Stain免染蛋白染色試劑。

      Invitrogen No-Stain蛋白標記試劑與蛋白分子的賴氨酸側鏈部分形成共價鍵，可在每孔上樣 1–80μg總蛋白的上樣量范圍內保持優良的檢測線性。該試劑可使用UV、綠色LED（Ex 520 mm）或藍色LED（Ex 488 mm）光源激發，發射波長為590 nm。

      iBright FL1500同時配置有LED綠色透射光源（用于透明SDS-PAGE凝膠的激發）、反射式藍（Epi-LED 455-485nm）、綠（Epi-LED 515-545nm）激發光（蛋白轉印膜的染料激發）和波長范圍568-617nm的熒光發射濾光片，可完美勝任蛋白凝膠、蛋白印跡的Invitrogen No-Stain蛋白免染熒光標記成像和對蛋白Blot的TPN檢測。

三、Western Blot TPN方法應用的iBright FL1500熒光檢測通道方案

      基于《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-1》的討論意見，iBright FL1500的Em3、Em4兩個檢測通道只能二選一。而Western Blot實驗引入Invitrogen No-Stain熒光染料進行TPN校正后，為確保各靶蛋白條帶、泳道上總蛋白熒光信號的特異性，TPN需單獨占用EM2發射信號通道。

iBright FL1500印跡熒光成像分析儀熒光檢測通道配置

      iBright FL1500可供分配給各蛋白條帶熒光信號檢測的通道只有EM 1、EM 3（或Em 4）、Em 5三個。這正是iBright FL1500系統配置5個熒光通道，但引入TPN方法后最多只能同時測3個靶蛋白的原因。
       其中，EM 1綠色熒光通道在檢測基質復雜樣品Blot時，很可能還會受到背景熒光的干擾。為改善檢測信噪比，選擇靶蛋白熒光二抗時，可參考以下經驗做法：低豐度靶標，盡量用亮度較亮的短波長熒光基團標記二抗（如Alexa Fluor 546和Alexa Fluor Plus 647）；而高豐度靶標，則選用波長較長熒光基團標記抗體（如Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor Plus 800）。
       至于如何在Western Blot實驗中獲取免染熒光標記Blot總蛋白圖像，且聽《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-3》為您分解。

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