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撥開云霧見月明——英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-4
iBright FL1500 藍綠透射光源的檢測應用
Western Blot熒光成像分析儀的江湖上，伯樂ChemiDoc MP、GE Amersham ImageQuant 800 Fluor（AI800 Fluor）、耶拿UVP ChemStudio Plus和賽默飛Invitrogen iBright FL1500這四雄，要論硬件配置上最顯著的區別，恐怕是非透射光源（Transilluminator）莫屬。因為，伯樂、UVP的系統用了經典302nm的透射紫外臺（Trans-UV）；AI800 Fluor默認裝備是LED透射白光（LED trans-white），當然可以選配AI800 UV升級模塊；而iBright FL1500標配是一臺LED藍綠光透射儀（green-LED transilluminator）。
很明顯，GE主打Western+蛋白凝膠圖像分析，Bio-Rad和UVP是要兼顧核酸、蛋白凝膠成像需求，而Thermo Fisher則意圖實現凝膠類等透明樣品的激發、照明多樣化檢測。那iBright FL1500的這一設計究竟是銳意創新的結晶，還是嘩眾取寵的敗筆？這一問題值得探討。
一、透射藍綠色光源在核酸凝膠檢測中應用的表現
根據文獻報道和廠商使用說明，對4大類核酸常用熒光染料標記凝膠成像激發方案匯總后，可獲得表1所列信息。
表1 常見核酸熒光染料激發波長列表
樣品類型 | Trans-green (490–520nm) | Trans-UV (280–320nm) | |
核酸凝膠 | Ethidium Bromide (EB) | ● (518 nm) | ●● (302 nm) |
GelRed | ● (488 nm) | ●● (302 nm) | |
GelSafe | ● (514 nm) | ●● (309 nm) | |
GelGreen | ●● (500 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Gold | ●● (495 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Safe (DNA) | ●● (502 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Green I (dsDNA) | ●● (497 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Green II (RNA) | ●● (497 nm) | ● (302 nm) | |
Goldview/AO (＞1 kb DNA) | ●● (491 nm) | ●● (294 nm) | |
科研實驗中不少熒光試劑，在紫外、藍光波長下都有強度不等的吸收峰。理論上，可使用其中任何一種光源激發。
以溴化乙錠（EB）為例，它的激發峰有兩個：波長300 nm最大激發峰（主激發峰）和波長518nm次激發峰，次激發峰強度明顯低于紫外波長激發峰。藍綠光透射儀雖然可以有效激發EB，而且經1.25kb基因擴增產物瓊脂糖凝膠成像對比證明，用302nm紫外光透射儀激發和基于iBright FL1500 Western成像分析儀檢測，所獲凝膠圖像效果極其接近。
廠商發布的熒光染料技術資料中推薦的激發波長，素有主激發峰波長、可用激發波長(次激發波長)之分。在主、次激發波長的條件下，熒光基團發光強度有差異，使得相同曝光時間內，凝膠的中、低豐度樣品條帶的圖像信號表現可能不一致。若成像條件未經優化，為強化弱信號條帶檢測而延長曝光時間，不僅會引入更多圖像背景噪音成份，還可能造成強信號條帶過飽和，高中低信號條帶強度對比失真。而基于過度曝光的圖像信號定量條帶樣品含量，不符合ImageJ指南關于圖像分析中運用朗伯-比爾定律的條件。
一般情況下，采用熒光試劑最大激發峰波長檢測，具有更好信噪比，有助于提高檢測靈敏度。因此，樣品豐度的定量分析應基于染料的主激發波長測定，而定性分析（如樣品分子量對比鑒定）可以采用次激發波長檢測。
整體上，波長490-520 nm藍綠光透射儀與凝膠成像分析儀標配302nm透射儀（波長范圍280–320nm，輻射能量峰波長302nm），二者可激發的熒光染料種類基本重疊。
對兩種文獻報道中常用的核酸相對定量分析染料SYBR Gold、SYBR Green的激發效果，藍綠色激發光顯然更優。而302nm紫外則最適于溴化乙錠EB、GelRed 和GelSafe的檢測。
Gel Safe類核酸安全無毒染料，雖兼容藍光、紫外兩種激發波長，但基因克隆實驗中，藍綠光照射可避免凝膠觀察和切膠過程中，人體和樣品的紫外線暴露損傷風險。故GelRed、GelSafe等染料在實際使用中，更多的是基于藍綠光而非紫外線來檢測。何況，LED光源使用壽命比紫外燈長，無須定期更換，節省管理維護成本。
因此，核酸凝膠檢測應用，iBright FL1500的490-520nm波長透射儀配置方案要優于常規紫外透射儀。
二、藍綠色透射儀在蛋白檢測中的應用
生物醫學實驗中蛋白樣品類型多樣，手工和預制SDS-PAGE凝膠，常規免染型凝膠和基因克隆平板都是常用樣品。
蛋白免染凝膠熒光的應用，iBright FL1500熒光成像儀不支持伯樂的蛋白免染凝膠檢測，只能使用英捷免染熒光試劑。這一點在《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-2》已有討論。
有文獻報道了用iBright FL1500 的LED藍綠光透射儀從底部照射搭載有GFP基因的克隆培養板，對靶蛋白表達克隆進行快速篩查和克隆熒光計數分析。
表2 透射藍光與302nm紫外激發的蛋白凝膠熒光染料對比表
樣品類型 | Trans-green (490–520nm) | Trans-UV (280–320nm) | |
蛋白凝膠 | SYPRO Ruby (總蛋白) | ● (460 nm) | ●● (280 nm) |
SYPRO Red (總蛋白) | ●● (520 nm) | ● (300 nm) | |
SYPRO Tangerine (總蛋白-WB) | ●● (490 nm) | ●● (300 nm) | |
Oriole (總蛋白) | ●● (302 nm) | ||
Flamingo火烈鳥(總蛋白) | ●● (490-520 nm) | ||
Pierce Krypton (總蛋白) | ●● (520 nm) | ||
Pro-Q Diamond (磷酸化蛋白) | ●● (520 nm) | ||
Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白) | ●● (302 nm) | ||
Pro-Q Emerald 488 (糖基化蛋白) | ●● (510 nm) | ||
InVision His-tag (His標簽蛋白) | ●● (LED白光板替代) | ●● (302 nm) | |
免染熒光應用 | 支持總蛋白定量分析 | ●● (英捷no-stain試劑) | ●● (伯樂Stain-free膠) |
菌落平板 | GFP表達克隆篩查 | ●● (490 nm) | |
表2數據顯示：蛋白凝膠熒光檢測應用，490-520nm藍綠光和302nm透射儀的適用性各有千秋。用于凝膠總蛋白、翻譯后修飾蛋白的定量分析的常用熒光染料檢測的支持方面，兩種透射光源都存在短板，難以有效覆蓋全部應用。相對而言，透射藍綠光源的兼容性更好。
這給了我們一個有益的啟示：在考慮蛋白凝膠成像分析系統配置中，如有可能，應將紫外、藍光兩種透射光源相結合，可極大提升系統蛋白凝膠檢測應用的靈活性。
iBright FL1500只能裝配藍綠透射儀，無紫透射外臺可供升級。而ChemiDoc MP、UVP ChemStudio Plus可以在標配基礎上加配藍光屏或LED透射藍光臺（trans-blue）,通過搭配，兩種檢測光源取長補短，相得益彰，實現檢測功能擴展的自由。
三、小結
作為一款主要定位于Western blot實驗印跡熒光、化學發光ECL檢測的高端成像分析儀， Invitrogen iBright FL1500通過引入藍綠透射光源和白光板這套配置，實現了對核酸凝膠、蛋白凝膠的熒光、可見光檢測分析的有效兼顧，從技術層面來說無疑非常成功。
正所謂尺有所短寸有所長，iBright FL1500不可能是完美無缺的杰作。
首先，在核酸凝膠檢測上，由于官方只證實藍綠透射儀可以有效支持EB標記染料的成像分析，但缺少EB染料標記核酸定量檢測動態線性范圍，以及這一線性范圍與基于標準302nm波長檢測條件下動態范圍的對比數據。當用于高濃度的核酸樣品（如PCR擴增產物）、低豐度樣品（低表達mRNA）和稀有珍貴樣品的定量分析時，若無相應驗證過程，則數據可靠性難免存疑。
其次，在蛋白凝膠檢測上，iBright FL1500藍光透射儀可支持總蛋白檢測、修飾后蛋白檢測，但依然存在對Oriole (總蛋白檢測) 、Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白檢測)等染料不兼容的問題。
此外，不支持已廣泛應用的伯樂免染凝膠熒光的檢測。
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