(續：生物醫學樣品微量紫外光度測定的技術原理和方法-上)

四、NanoDrop系列微量紫外分光光度計

       吸光度計算公式A =ε·b·c表明，在一臺光度計上測試同一個樣品，選用不同測試光程，則A260測定值不同。理論上，1.0mm光程的A260讀數相當于10mm光程模式讀數的1/10。若采用更短的0.1mm光程測試，A260讀數會進一步減小至標準光程的1%。

       將上述計算公式轉換一下，得到：

       c = A/(ε·b) ……................................. 公式2

       公式2表明，同一臺光度計、采用長短兩種光程，分別測得的2個樣品A260讀數相同時，短光程測定模式對應的樣品實際濃度，要高于長光程測定模式下所測定樣品的真實濃度。

        換言之，在同一臺光度計檢測器的線性檢測范圍內，短光程測定模式提高系統的吸光度測定范圍、樣品濃度測定上限。以Implen NanoPhotomete NP80、N60微量紫外可見光度計和C40常量紫外可見光度計為例：NanoVolume功能模塊（光程0.67mm/0.07 mm兩檔可調）與標準10mm光程比色皿測定模塊比，吸光度范圍上限和可測樣品濃度上限提升了125倍以上（2-3個數量級）。

       因此，高濃度樣品適合用短光程模式測定，而較低濃度的樣品可以嘗試采用標準10mm、1.0mm或0.1mm光程來檢測。這樣做目的是使吸光度讀數盡可能落在儀器檢測器吸光度線性響應區間，減少誤差，提高測試精度。

       新型微量紫外可見光度計的1mm光程相當于常規紫外可見光度計標準10mm比色皿檢測光程的1/10。理論上，其可測的樣品濃度上限相當于標準比色皿測定上限的10倍。若要進一步提高可測樣品濃度上限，進一步壓縮樣品檢測光程是一行之有效的辦法。

       PCR反應體系構建過程中經常用漩渦振蕩來充分混勻樣品，而同時使PCR管內壁出現大量大小不等的液滴掛壁吸附。如此小的液滴，須離心處理才能將其回收。

       或許受此啟發來的創造靈感，Charles W. Robertson等人在2000年創建NanoDrop Technologies公司（已并入賽默飛公司），專門研究如何利用液體表面張力特性開發一款可利用0.5 ~ 1 μL體積樣品完成核酸測定的工具。功夫不負有心人，其首款產品NanoDrop 1000于2003年上市，獲得了巨大成功，并由此掀起了一場席卷全球的Drop-Style設計思潮。

       由于液體表面張力作用，微小液滴可在一定尺度內被任意拉伸成高度、粗細不同的雙曲面柱體。測試光束從柱體中軸穿透時，光程長度可以被精確控制。這樣，不僅實現了將測試光程長度壓縮到1.0mm以內的目標，還可以進一步劃定0.05mm、0.02mm、0.01mm等更多個亞毫米級的短光程。

NanoDrop系列微量紫外可見光度計檢測光程表

       通過多光程自動調節（auto-ranging），從而在應對各種高濃度樣品測試挑戰時，從容不迫、時游刃有余。

       NanoDrop微量紫外可見光度計的光程auto-ranging具體細節，從官方資料無從可考。不過，原GE health care開發NanoVue Plus（現歸Biochrom公司）的技術資料，可讓我們窺視光程自動調節的一些端倪。

       NanoVue Plus有0.2mm或0.5mm兩檔測試光程可選：較低濃度樣品應使用0.5mm的光程，較高濃度的樣品應使用0.2mm的光程。在DNA、RNA、寡核苷酸、Tm計算、Cy染料、蛋白質紫外光和蛋白質A280方法中，由于事先樣品的濃度范圍未知，系統默認采用自動調整光程的功能選項。

       自動光程功能激活后，儀器首先進行樣品的0.5mm光程測量，如測得的吸光度高(>1.7A)，則系統自動調整為用0.2mm光程重新測量樣品，直至測試紙落入系統檢測器最適測定區間。在該功能模式下，樣品的掃描總是先后使用兩個光程進行。

       測試后的樣品濃度等，系統自動進行路徑長度和吸光度歸一化化(Pathlength and Absorbance normalization)處理，最后給出相當于標準10mm光程的修正值。

（待續）