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美人首飾侯王印盡是沙中浪底來——牛人用伯樂CFX Connect實時熒光定量PCR儀都干了啥？-下
(續《牛人用伯樂CFX Connect實時熒光定量PCR儀都干了啥？-上》)
8、lncRNA、microRNA表達分析和RNAi沉默驗證（6篇）
長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白，長度可達200堿基的RNA分子。它們可通過與DNA、RNA及蛋白質結合，參與基因轉錄前、轉錄中、轉錄后（與轉錄物形成互補雙鏈干擾mRNA的剪切）及轉錄后翻譯與蛋白質磷酸化等過程調控，影響干細胞重編排、細胞分化。
qRT-PCR測定特定組織和細胞中LncRNA表達水平，可分析LncRNAs 的差異表達模式。同時測定lncRNA和編碼基因的mRNA表達水平，可找出表達顯著相關的lncRNA-mRNA對。而基于lncRNA與mRNA表達相關性及lncRNA與mRNA編碼基因位置關系，可推測lncRNA對靶基因的調控功能。
研究人員采用CFX Connect熒光定量PCR儀，分別對軟、硬基質條件下培養hPSCs的內胚層分化階段特異性基因的誘導、LINC01356、LINC00458的表達水平的檢測結果表明：下調的LINC00458顯著抑制內胚層特異性基因FOXA2和SOX17及EOMES和GATA6的mRNA水平，表明LINC00458在內胚層響應軟底物的分化中發揮重要作用，而LINC00458缺失會影響內胚層基因表達，提示它對軟底物誘導的內胚層分化不可或缺。采用ChiP-qPCR方法對含有內胚層特異性轉錄調控因子SMAD2、SMAD3 siRNAs的hPSCs中RIP復合物中LINC00458、MAL581的檢測表明，軟基質培養誘導LINC00458與SMAD3相互作用。研究結果提示：軟底物誘導的LINC00458是通過SMAD2/3依賴途徑調節hPSC內胚層的特化。
9、植物基因研究（6篇）
CFX Connect實時熒光定量PCR儀被用于研究植物組織發育中起調控基因（如MADS-Box-基因、homeobox gene同源盒基因、光感受器基因）特異性表達模式、植物形狀控制等位基因鑒定和植物特殊發育階段基因QTLs分析等。
10、基因突變的檢測（5篇）
實時熒光定量PCR用于SNP基因型分析和拷貝數變異(CNV)檢測屬于常規經典應用。
11、NGS基因測序文庫的定量（4篇）
NGS測序所用起始樣本核酸質量和靶標富集方法不同，使測序文庫濃差異極大。而文庫核酸樣本的精確量化和歸一化，將確保每個合并文庫測序所需深度，所有樣本達到所需的測序reads量。用實時定量PCR儀和SYBR Green對經多重PCR反應制備富集的測序文庫片段定量，測定文庫準確濃度是NGS分析流程中文庫質控的關鍵步驟。
12、ChIP-qPCR檢測（2篇）
染色質免疫沉淀法（Chromatin Immnoprecipitation，ChIP)是一種基于抗原與抗體免疫雜交原理，用特異性抗體對染色質上結合的組蛋白、蛋白修飾物、轉錄因子、輔因子等特定抗原和與抗原結合的DNA片段實現分離富集的實驗技術。
ChIP-qPCR技術則是融合ChIP和實時定量PCR技術各自所長。利用抗體特異性富集與特定轉錄因子、組蛋白修飾結合的DNA 片段，以qPCR儀、SYBR 熒光染料對與特定蛋白結合共沉淀的DNA的定量分析。該技術可原位、真實地反映目的蛋白或蛋白修飾在特定基因位點的分布和豐度，查找在靶基因啟動子上轉錄因子結合的證據，是分析蛋白之間相互作用、組蛋白修飾對基因表達的影響等重要技術手段。ChIP-qPCR基本檢測流程包括：固定處于特定細胞周期的活細胞→染色質剪切為不同長度范圍的小片段→利用抗原抗體反應對染色質免疫沉淀→蛋白結合的DNA片段純化→qPCR檢測。
德國馬普分子生理學研究所的研究人員對在減數分裂中聯會復合體（synaptonemal complex，SC）Pch2（pachytene checkpoint 2，一種細胞減數分裂過程粗線期的細胞周期檢查點蛋白，屬AAA+ ATP酶）在起始識別復合物（Origin Recognition complex，ORC）結合位點募集機制的研究中，借助于ChIP描繪出減數分裂G2/前期Pch2染色體關聯圖譜，揭示了Pch2在整個基因組中的特異性結合位點。用CFX connect實時熒光定量PCR儀對處于減數分裂G2/前期階段的ndt80Δ 細胞中 GAP1、TDH3、PPR1 三個轉錄活性基因位點、各自編碼區的下游和上游DNA序列進行了 ChIP-qPCR 分析。實驗結果表明，Pch2的染色體募集具有減數分裂特異性和RNA聚合酶II驅動的基因轉錄活性區域依賴性，Pch2分子中的非催化功能NH2端結構域(NTD) 是Pch2招募到染色體所必需的結構。
13、其它方面的應用（4篇）
13.1 非天然堿基半合成生物體基因表達的檢測
加拿大Scripps研究所的研究人員采用非自然的堿基對(unnatural base pair, UBP)合成了一種可儲存遺傳信息并能穩定表達的半合成生物體(semisynthetic organism, SSO)。對含UBP堿基質粒DNA的檢測用的是CFX Connect實時熒光定量PCR儀和SYBR Green標記法。
13.2 差示掃描熒光法（Differential Scanning Fluorimetry）
差示掃描熒光法，亦可稱為蛋白熱穩定性分析（Protein thermal shift），是利用實時定量PCR儀緩慢升溫熔解實驗，根據熔解過程中實時熒光變化，對多個基團結合而成化合物或生物大分子的熱穩定性評價，用于篩選能與靶點結合的小分子藥物、抗體等。測試依托的正是實時熒光定量PCR系統的HRM分析功能。
研究人員采用SYPRO orange染料在CFX-Connect 系統上完成了與胱硫醚β合成酶 ( cystathionine βsynthase, CBS )為靶點的富含雜環雜芳香族結構的小分子化合庫篩選。
13.3 降落實時熒光定量PCR分析應用
國內學者報道了基于降落PCR（touchdown PCR）原理開發的降落實時熒光定量PCR分析（Touchdown qPCR Assay）方法。采用CFX-Connect結合EvaGreen 或SYBR Green分別按常規雙溫循環法qPCR、Touchdown qPCR法對低豐度樣品檢測對比試驗結果顯示，確認了后者在檢測靈敏度、擴增效率上的明顯優勢（了解touchdown PCR參考《擴增條件再優化在實時熒光定量PCR實驗中的意義和有效途徑-下》）。
13.4 染色體構象捕獲-實時熒光定量PCR分析(3C-qPCR)
人們在基因表達調控研究中關注到的是基因及上下游調控元件線性排列順序。而即有證據表明，染色質之間相互作用，基因表達可被處于立體空間一定距離范圍的遠程調控元件所調控。
染色質構象捕獲（chromosome conformation capture, 3C）技術正是為研究基因調控相關元件在染色質內空間內分布而建立的。其指導思想是：空間相隔一定距離的增強子和啟動子等基因組元件，能通過染色質片段間相互作用被帶入到基因的特定區域，調控臨近位置的基因轉錄。位置相近、可相互作用的兩個染色質片段內的DNA片段因此而連接，形成一個DNA的unction reads。對被分析的兩個目標基因片段設計引物，將這兩個區域嵌合而成的junction reads擴增，根據PCR產物評估目的片段之間相互作用關系的有無和強度，可找出與不同轉錄因子作用的轉錄元件及調控靶區。分析兩個片段在的基因組區域和染色質上定位，即可得到DNA間、染色質區段間相互作用關系圖譜。
3C主要操作流程包括：與ChIP-qPCR類似細胞甲醛固定染色質結構→限制性內切酶將DNA酶切→DNA連接酶對片段末端連接、蛋白酶K消化所結合的蛋白質，獲得含有相互接觸DNA片段→實時熒光定量PCR檢測，獲得染色質不同位點相互接觸數據，分析得出相互作用染色質的三維分布圖譜。
三、關于CFX Connect實時熒光定量PCR儀引入科研實驗的思考
迄今為止，與CFX Connect實時熒光定量PCR儀有關的公開研究論文還不到200篇。因經驗和對qPCR實驗目的理解的偏差，本文對qPCR實驗應用的歸類難免有不妥之處。但不可否認，CFX Connect在實際應用中所跨越深度和廣度，已基本觸及到目前基于實時熒光定量PCR技術所能開創的空間極限。一款僅配置有雙熒光通道的系統，其展現的應用實力，與任何高配、高價、高端熒光定量PCR系統比，都已毫不遜色。這一事實，足以讓人震驚。
美國哥倫比亞大學內科和外科醫學院Gerard Karsenty團隊中一名叫Jianwen Wei的學者，2015-2016年間，作為第一作者連續在Cell、Cell Metab上發了2篇文章。因實時披露美國新冠疫情信息在我國如今已是婦孺皆知的約翰霍普金斯大學，其下屬一研究團隊實驗室用的也正是是CFX Connect實時熒光定量PCR儀。某種程度上，也似乎暗示：就實時熒光定量PCR分析實驗而言，儀器熒光通道數量多寡，可能并非決定實驗成效的關鍵因素。就調研所揭示的想象看，CFX Connect的性能表現，對于渴望在Cell、Cell Metab、Nucleic Acids Res、Nat Ecol Evol、Nat Struct Mol Biol、Nat Commun、J Exp Med、Sci Adv這檔頂流學術論壇留名的人們來說，是夠格的。
實際上，伯樂CFX Connect實時熒光定量系統的技術性能，在目前國內外同類產品中足夠硬核。這一點，《慧眼識珠看伯樂CFX connect實時熒光定量PCR儀》有專門討論。結合調研所披露的事實和CFX Connect與國產同類產品趨同的售價，在當前科研儀器建設投入偏緊的新形勢下，重新審視實時熒光定量PCR儀規劃，對于充分發揮儀器建設的財政支持效能、減少不必要浪費，無疑具有積極引導意義。
進口品牌中與CFX Connect同一檔熒光定量PCR儀還有一款，就是ABI的QuantStudio 1（QS 1）。QS1系統檢測模塊配置三個熒光通道（它拋棄CFX Connect中雞肋般的FRET通道，換上了JUN、ROX、Texas Red染料通用檢測通道）。這對于多重實時定量分析發燒友而言，上triplex qPCR實驗都已不在話下。雖然CFX Connect、QS 1都用的96×0.2mL熱循環模塊， 但CFX Connect的模塊最大變溫速率5.0℃/秒，顯然完勝QS 1系統的3.5℃/秒。本文沒有選QS1作為范例予以討論，是因截止至發稿，我們都無法確信在PubMed數據庫中收集到足夠數量的與QS1有關的qPCR實驗文章。
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