一、小CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀在大牛手里表現(xiàn)不俗

       CFX Connect是伯樂CFX系列實(shí)時熒光定量PCR儀的基礎(chǔ)產(chǎn)品，可用于2重實(shí)時熒光PCR分析和FRET雙雜交探針熒光檢測，2012年3月上市。PubMed數(shù)據(jù)顯示:從美國馬里蘭州陸軍研究實(shí)驗(yàn)室“球狀芽孢桿菌Spo0F H101R突變對菌株適應(yīng)性的影響(Effect of the Bacillus atrophaeus subsp. globigii Spo0F H101R Mutation on Strain Fitness)”的研究報告公開發(fā)表的2012年11月，到2022年3月的10年間，用CFX connect進(jìn)行的qPCR實(shí)驗(yàn)總計已發(fā)表論文186篇（剔除預(yù)印本平臺已發(fā)表的一篇），其中IFoid分7.0以上期刊發(fā)文總數(shù)45篇（占比近25%）。

表1 部分用CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀開展實(shí)驗(yàn)的研究論文（2015-2022）

二、CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀已開展的研究應(yīng)用

       單從文章數(shù)量上看，CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀用戶略顯得小眾一些。莫非是因CFX Connect的熒光檢測通道數(shù)量少，限制了其功能應(yīng)用靈活性的緣故？

       事實(shí)并非如此！

       在PubMed上，我們查閱了這186篇正式刊文，對其中qPCR實(shí)驗(yàn)內(nèi)容部分逐一核實(shí)，并按熒光定量分析所直接服務(wù)的階段性實(shí)驗(yàn)目標(biāo)進(jìn)行歸類。結(jié)果顯示，CFX Connect所涉及的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用類型超過13個。按各類別下發(fā)表文章的數(shù)量排序，結(jié)果如下。 

1、基因表達(dá)水平定量分析（42篇）

       常規(guī)基因表達(dá)分析應(yīng)用包括腫瘤、炎癥、自身免疫疾病、內(nèi)分泌和代謝疾病等疾病病理狀態(tài)下、應(yīng)激反應(yīng)、飲食/藥物/治療干預(yù)、環(huán)境脅迫（熱脅迫、電離輻射）、CRISPR介導(dǎo)的基因破壞后、動植物組織細(xì)胞及微生物的標(biāo)志性基因表達(dá)水平的變化。

       基因融合（gene fusion）是指因染色體易位、中間缺失或染色體倒置等導(dǎo)致兩個基因部分序列嵌合形成一個新的突變基因。實(shí)時熒光定量PCR分析是對融合前原來兩個基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行的各基因表達(dá)的mRNA進(jìn)行檢測。奧地利研究人員在對核孔蛋白NUP98的融合蛋白在白血病發(fā)生過程中所處地位的研究中，分別對用慢病毒載體搭載NUP98核孔蛋白- KDM5A組蛋白去甲基化酶5A融合基因轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞、急性髓細(xì)胞性白血病(AML)小鼠表達(dá)的mRNA進(jìn)行了定量分析。

2、細(xì)胞發(fā)育/分化/增殖/浸潤/凋亡標(biāo)志基因的表達(dá)分析（38篇）

       這部分實(shí)驗(yàn)主要包括調(diào)控細(xì)胞（含免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞）誘導(dǎo)發(fā)育、分化、增殖、凋亡、浸潤功能有關(guān)信號通路（Wnt通路、Notch通路、MAPK通路、p53/p21通路等）關(guān)鍵基因、細(xì)胞發(fā)育各階段標(biāo)志基因表達(dá)的分析。

       RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）Lin28家族包括LIN28A和Lin28B兩個成員，具有相似的結(jié)構(gòu)域和功能，可以維持細(xì)胞不斷增值、去分化。micorRNA分子let-7在線蟲胚胎不同發(fā)育階段過渡中或在細(xì)胞分化過程中起到切換開關(guān)的關(guān)鍵作用。Lin28可抑制低分化細(xì)胞中l(wèi)et-7前體miRNA加工為成熟let-7 miRNA。而Lin 28A/Lin 28B是let-7 miRNA的直接靶點(diǎn)，通過Lin28基因3’-UTR區(qū)抑制lin28的表達(dá)。lin28與let-7存在雙負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。

       內(nèi)耳耳蝸內(nèi)的感知機(jī)械震動的毛細(xì)胞(Hair cell, HC)的丟失是導(dǎo)致人類耳聾的主因。HC和支持細(xì)胞(Sertoli Cell, SC)源于一共同的祖細(xì)胞池-前感覺細(xì)胞。耳蝸前感覺細(xì)胞的分化和增殖依賴于Notch、成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的復(fù)雜調(diào)控。在有絲分裂后期，最終分化為HC的前感覺細(xì)胞上調(diào)螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子ATOH1，對HC分化至關(guān)重要。其余前感覺細(xì)胞則由Notch信號介導(dǎo)發(fā)育成SC。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號的過度激活或Atoh1表達(dá)的異位激活，會刺激新生小鼠/組織中的耳蝸SC重新進(jìn)入細(xì)胞周期并形成新的HC。而抑制Notch信號則可誘導(dǎo)SC轉(zhuǎn)化為HC。

       約翰斯霍普金斯大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)表明，祖細(xì)胞特異性Lin28B和卵泡抑素(follistatin, FST)的短暫激活，將成熟耳蝸SC重編程為祖細(xì)胞樣細(xì)胞，使從聽力正常的幼年小鼠中分離出的耳蝸SC具備再生能力，在體外增殖形成新的HC。Lin28B驅(qū)動SC重編程的同時，F(xiàn)ST可平衡Lin28B對轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β)信號的過度激活。證實(shí)Lin28B和FST共激活啟動SCs的HC再生，可能是內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制的主要調(diào)控因子。實(shí)驗(yàn)中，對包括毛細(xì)胞（Atoh1、Gfi1、Pou4f3、Scx、Twist1）、毛細(xì)胞骨架蛋白MYO7A、Fst、啟動多能性(Hmga2、Trim71)、Lin28家族（Lin28a、Lin28b）、干細(xì)胞表面標(biāo)志Sox2、Notch信號調(diào)節(jié)基因Lfng（lunatic fringe）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族（Bmp2、Bmp4）、轉(zhuǎn)化生長因子β超家族（Inhba、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3）等在內(nèi)的26個功能性基因的表達(dá)進(jìn)行的檢測，就采用了CFX-Connect和SYBR Green熒光染料標(biāo)記的方法進(jìn)行。

3、干細(xì)胞發(fā)育分化機(jī)制研究（26篇）

       誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是指向體細(xì)胞中導(dǎo)入特定基因或基因產(chǎn)物，誘導(dǎo)細(xì)胞重編程而得到的具有和胚胎干細(xì)胞類似的發(fā)育多潛能性的一種細(xì)胞類型。iPS具有可持續(xù)增殖能力并可分化成各種細(xì)胞，在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等與胚胎干細(xì)胞極為相似，可分化成人體各組織器官的細(xì)胞類型。在疾病模型的建立研究、細(xì)胞治療、新藥研究等具有重大潛在應(yīng)用價值。

        揚(yáng)州大學(xué)研究人員從黑羽狼山雞中分離雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），轉(zhuǎn)染Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A四種誘導(dǎo)基因后，將CEF重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），這些干細(xì)胞通過BMP4 / BMP8b / EGF進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells， PGC）后，將其移植到白普利茅斯洛克雞胚胎中，產(chǎn)生功能性精子或卵細(xì)胞。通過自交產(chǎn)生具有供體特征的189/509體細(xì)胞衍生的雞。證明了從體細(xì)胞克隆禽類的可行性。對iPS的四個多能性標(biāo)記基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28A表達(dá)情況的分析實(shí)驗(yàn)，用的是CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀。

4、藥效毒理作用和藥效靶點(diǎn)分析（17篇）

       實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在藥物研究方面的應(yīng)用主要集中在3個方面。

       一是藥理作用分子機(jī)制分析（如藥物作用對靶信號通路中關(guān)鍵基因、藥效指示基因及細(xì)胞增殖分化關(guān)鍵分子表達(dá)調(diào)控），二是藥物作用靶點(diǎn)分析（如對基質(zhì)金屬蛋白酶-9），三是其次還被用于疫苗免疫原性評價、中藥提取物的安全性評價。

5、微生物檢測與鑒定（15篇）

       CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀在細(xì)菌研究中應(yīng)用，包括對16SrRNA基因豐度測定評價細(xì)菌適應(yīng)度、細(xì)菌代謝功能基因測定、環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因的檢測等。病毒檢測（如市政廢水中SARS-CoV-2病毒）、真菌檢測也有報道。

6、生物標(biāo)志物研究（12篇）

       生物標(biāo)志物一般是指可以標(biāo)記系統(tǒng)、組織器官、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能改變或可能發(fā)生改變的生化指標(biāo)，如核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類以及體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的生物活性分子等，常用于疾病診斷分類，判斷疾病分期、發(fā)展及嚴(yán)重程度，評價新藥或新療法的安全性及有效性，以及用于預(yù)測個體發(fā)病風(fēng)險和高危人群臨床篩查等。

       CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀被用于對SARS-CoV-2感染的嚴(yán)重程度和預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物（白細(xì)胞介素-3）、結(jié)直腸癌基因表達(dá)特征（MSI、BRAF突變和MLH1啟動子甲基化）、食管鱗狀細(xì)胞癌放化療療效的預(yù)測生物標(biāo)志物（MMS22L）、巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的炎癥標(biāo)志物、肺纖維化致病標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的檢測。

7、藥代動力學(xué)基因多態(tài)性和耐藥基因檢測（7篇）

       一般認(rèn)為，藥物體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及作用靶點(diǎn)基因的遺傳變異和表達(dá)水平變化，會影響藥物的體內(nèi)濃度和藥物反應(yīng)的個體差異。藥物基因檢測結(jié)果可用于指導(dǎo)臨床個體化用藥、評估嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險和指導(dǎo)新藥研發(fā)和評價。

       CFX Connect實(shí)時熒光定量PCR儀被報道用于真菌、細(xì)菌、腫瘤治療藥物的耐藥基因檢測以及藥代動力學(xué)相關(guān)基因的多態(tài)性的研究中。

(待續(xù))