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慧眼識珠看伯樂CFX connect實時熒光定量PCR儀

       伯樂CFX Connect 是繼CFX96 Touch之后,在2012年推出的具有三個熒光檢測通道的基礎型實時熒光定量PCR儀(注:CFX Connect已于2022年5月停產,由新款CFX Duet取代)。它沿用了伯樂熒光信號光學檢測單元、PCR熱循環反應模塊二合一結構設計,可實現在一個循環中進行2重熒光PCR反應(multiplex real-time PCR assay, multiplex quantitative PCR, multiplex qPCR和羅氏 FRET雙雜交熒光探針檢測。可用于核酸定量(nucleic acid quantification,如SARS-CoV-2感染篩查與診斷)、基因表達水平分析(gene expression analysis)、基因突變檢測(如常用的SNP、CNV、QTL)、轉基因檢測(genetically modified organism,簡稱GMO,如檢測轉基因大豆、玉米、棉花等)及PCR擴增產物的特異性驗證分析(melt curve analysis、HRM assay)等多種研究應用。

伯樂CFX connect 實時熒光定量PCR儀.jpg

      CFX Connect所用的96×0.2mL PCR模塊的最大升溫降溫速度、模塊內溫度均一性、溫度準確度、退火溫度梯度優化功能等PCR反應模塊關鍵技術性能,與伯樂CFX96、CFX96 Touch 實時熒光定量PCR系統所用的反應模塊保持一致,與AB 7500 Fast(96×0.1mL)、QuantStudio 5(96×0.2mL)和QuantStudio 6 Pro(96×0.2mL)的常用配置一致或接近。

伯樂-AB主流qPCR儀主要技術性能指標對比

品牌

Bio-Rad

Applied   Biosystems(AB)

型號

CFX Connect

CFX Opus   96

7500 Fast

QuantStudio 5

QuantStudio 6 Pro

熒光檢測通道數

2熒光+ FRET

5熒光+ FRET

5組藕聯通道

6組解耦通道

5組藕聯通道

檢測靈敏度

1拷貝人基因組基因模板

1拷貝RNaseP模板

檢測線性動態范圍

10個數量級

9個數量級

10個數量級

PCR樣品通量

96×0.2mL Low profile(10~30μL)

96×0.1mL (10~30μL)

96×0.2mL (10~100μL)

PCR升溫速率

最快5℃/sec,平均3.3℃/sec

5.5℃?sec

6.5℃/sec

PCR控溫精度

±0.2℃(target   at 90℃)

±0.5℃

±0.25℃

PCR溫度均一性

±0.4℃(10秒內達到90℃

±1℃

±0.4℃

退火溫度梯度設定

8個溫度梯度

6個溫度梯度

6個溫度梯度

3個溫度梯度

      從熒光檢測模塊類型看,CFX Connect、CFX96、CFX96 Touch和2020年新上市CFX Opus 96,都采用可移動、逐孔掃描的光梭式檢測單元。讀取熒光信號時,設定的熒光通道由光梭牽引動到每個反應孔中心正上方并短暫懸停,完成熒光激發和反應孔內樣品發射熒光信號收集。光梭式檢測模式消除了反應孔間的熒光交叉干擾(Cross-talk)和不同反應孔與熒光探頭之間的角度和光程差。因此,反應板不同位置的熒光測試信號無需ROX染料校正。這一點,所有CFX系列熒光定量系統相通。
      就檢測的靈敏度、動態范圍、可重復性這些關鍵性能而言,CFX Connect與CFX Opus 96、7500 Fast、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro等多熒光通道平臺,并無本質差異。
      CFX96、CFX96 Touch和CFX Opus 96配置的是6個熒光檢測通道(5熒光+1 FRET專用通道),而CFX Connect的檢測通道僅3個(2熒光+1 FRET通道)。但高低兩種光學配置的CFX系統,都有效支持SYBR Green I染料、TaqMan熒光探針(FAM、VIC、TET、HEX、CAL Fluor、Gold 540、Cal Fluor和Orange 560)、Molecular Beacon探針和1種FRET探針實驗應用。對實驗者而言,CFX Connect檢測通道數量減少,犧牲的是多重實時熒光定量PCR分析中每個循環中可檢測靶標的容量(單管內可同時測定的熒光探針標記靶標種數從3-5種降低為2種)。但CFX Connect系統依然可以進行FAM靶標+VIC內參組合這種最常見的雙重實時熒光定量分析(duplex qPCR)。而CFX Opus 96、7500 Fast、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro這類多熒光通道配置平臺理論上可勝任三重、四重的多色熒光定量分析任務,這對于臨床醫學、流行病學中呼吸道、消化道感染性疾病復雜病原菌的快速鑒別固然有利。但眾所周知,3重及更多種靶標的多重定量反應實驗,反應體系的優化與特異性、靈敏度驗證工作十分繁瑣和復雜,絕非科研實驗等閑事宜(多重實時熒光定量分析的涵義與應用意義和實施方法的問題,可參考《如何用MIQE標準指導多重實時熒光定量PCR實驗的流程與驗證設計?-上》)。從時間-效率比角度來說,CFX Connect的雙重熒光定量分析功能是完全實用、夠用的。這一點,目前已有大量實驗論文可以證實(可參考《美人首飾侯王印盡是沙中浪底來——牛人用伯樂CFX connect實時熒光定量PCR儀都干了啥?-上》一文)。
      退一步說,對于特殊類型研究課題,確需開展單管內多種模板測定分析時,另辟蹊徑,引入新型Green核酸染料高分辨率熔解曲線分析技術路線,CFX Duet完成5重以上的多重熒光定量分析也是完全可以實現的。
      至于CFX Connect實時熒光定量PCR儀明明配置了3個檢測通道數,為何只能進行2色熒光同步檢測的問題,可參考《實時熒光定量PCR儀熒光檢測通道數量的內涵淺析》一文,在此不作贅述。