(續：生物醫學樣品微量紫外光度測定的技術原理和方法-中)

五、Implen NanoPhotometer液滴壓縮技術

       通常，低鹽樣品（脫鹽后的蛋白溶液）、非極性溶劑、去污劑（如SDS、Triton X100）殘留或樣品溫度升高，均可導致液體表面張力顯著降低。依賴液體表面張力維持樣品的測試光路穩定的方法，很容易因溶液張力特征變化而致液柱拉伸失敗，造成測試誤差或難以獲得有效數據。特別是純化后的蛋白質樣品，表面張力低同時基質成分復雜，微量蛋白質的可靠測量向來都是充滿挑戰的任務。

       德國Implen公司是業內微量紫外可見光度計領域僅次于NanoDrop的著名廠商。所開發的NanoPhotometer系列微量紫外可見光度計全部采用的是由鉸鏈可開合密封上蓋和可控制升降的樣品基座組成的密封性檢測池。上蓋正中為石英玻璃反光鏡，基座中央為石英玻璃光學測試窗。樣品滴加到檢測窗口，測試光束從底座的測試窗向上穿過樣品后抵達頂蓋，被反光鏡反射后折回，再次通過樣品、測試窗口進入檢測器。上下兩個石英表面間距的2倍即測試光程的長度。微量測定功能的核心原理是獨特的液滴樣品壓縮技術（Sample Compression Technology）。

       所謂樣品壓縮技術是指：測試液滴添加到檢測池中測試窗口，放下密封上蓋后，液滴夾在基座、頂蓋反光鏡之間被擠壓成薄膜。膜的形成是測試表面對液體的物理擠壓所致，與液體自身的表面張力屬性無關，徹底擺脫測試光路對表面張力的依賴。而薄膜厚度可由底座的升降運動來控制，調整基座高度即可控制膜的厚度，即實現對測試光程的調節。                                              

       Implen采用兩個固定的錨點來定義路徑長度（True Path控制技術）。如圖所示，基座在錨點1時，基座-鏡面間距大，測試光路徑長。基座停留在錨點2時，基座-鏡面間距縮小，液滴更趨扁平，此時測試路徑較短。基座升降由磁鐵控制只能在兩個固定錨點之一定位，無法在除兩個錨點之外的任何位置停留。這樣確保了測試光程的精確設定，而不發生漂移。

       NanoPhotometer微量紫外可見光度計還為核酸和蛋白質的測定引入了自動光程設定功能（Automatic Path Length Setting）：通常，先在較長光程下測量，根據測得的樣品吸光度，判定樣品是否在路徑長度的有效線性范圍內。如樣品濃度超出該范圍，儀器將自動以較短的路徑長度重新測量。系統自動選擇適宜光程，確保測量結果的準確性。

Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計測試光程表

六、其他微量紫外光度測定技術和方法

6.1 NanoPhotometer測定原理類似技術

       德國Hellma公司的Traycell 2.0，是專為紫外可見分光光度計標準檢測池架開發的、可用于微量核酸蛋白樣本測定的石英比色皿。

       將樣品滴加到比色皿頂部的光學窗口，上蓋，與配套比色皿適配器組合后，安裝到標準檢測池架即可。測試完成，簡單擦拭比色皿光學窗口和上蓋，即可進行下一個樣品的測定。使用方法上，與NanoDrop One/One C、Implen NanoPhotometer NP80/60/50系列微量紫外可見光度計如出一轍。加樣和清理樣品殘留時，無需從檢測池架上取出TrayCell比色皿，比色皿與測試光束的相對位置始終保持不變，以測試結果的可重復性。

       TrayCell比色皿由主體部分（相當于NanoPhotometer的樣品基座）、帶反射鏡的密封蓋組成。主體部分嵌入光纖，用于傳導測試光束和接收樣品檢測的信號。因此，其工作原理、結構設計與Implen NanoPhotometer頗有相似之處。

       測定前，比色皿需要一定的準備操作：

       通常情況下或預估樣品濃度較低時，首先用1.0mm的光程測定。選擇較薄的適配器（安裝到比色皿底部）和數字標示為10的上蓋（測定吸光度值相當于標準10mm比色皿測定值之1/10，相當于樣品進行了10倍稀釋）；

       測定濃度較高的樣品時，直接采用0.2mm光程方案測定，選擇安裝較厚的適配器和標示50的上蓋（表明其稀釋因子為1:50）。

       測試光程（即樣品層厚薄）不同，所需最低樣品體積存在一定差別：0.2mm光程的TrayCell容量為0.7 - 4μL，1mm光程的TrayCell樣本容量為3 - 5μL。

       給比色皿添加適配器，在eppendorf BioSpectrometer 系列分光光度計的microcell、日立UH5300紫外微量測定模塊使用中，都是規定動作。

6.2 NanoDrop測定原理類似技術

       這類產品首推eppendorf開發的Cuvette G1.0微量比色皿。

       G1.0由鋁外殼和帶疏水性涂層的石英玻璃夾層制成，光路長度1 mm，測定樣品體積范圍1.5–10μL，主要涉及用于高濃度核酸和蛋白質樣品的檢測。

       G1.0的測定原理、點樣操作與NanoDrop OneC類似，都是借助測定界面的疏水作用和液體表面張力維持液柱和測試光路的穩定，光束與液柱法中軸重合、穿透樣品層后進入檢測器完成測試。每個樣品測試結束，簡單擦拭檢測窗口清理。

       Cuvette G1.0與TrayCell兩種比色皿均直接安裝于標準10mm光程檢測池架上使用。G1.0點樣時須從檢測模塊上取下，在桌面完成移液后，重新插回檢測池中。但G1.0上樣前無須適配器安裝，操作更簡便。Cuvette G1.0的售價與國產Nano 400這類固定波長的微量紫外可見光度計整機價格旗鼓相當。但若Hellma TrayCell比， G1.0收的智商稅還算有點良心。

參考文獻：

［1］Eppendorf μCuvette G1.0 Operating instructions

［2］Instructions for use UVette universal adapter

［3］Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual (Edition 1)

［4］NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.3)

［5］NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Revision E)

［6］NanoVue Plus Product User Manual (REV 1.4)

［7］Traycell 2.0 Quick Start Guide