讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-8

       在ImageJ軟件Subtract Background設置面板中，Disable Smoothing選項是其中一個事關選區背景扣除和分析結論成敗的關鍵性條件。
       本文接續Western Blot條帶分析中如何設置ImageJ軟件的背景扣除選項的話題，討論Disable Smoothing設置和運用方法。
       要掌握Disable Smoothing的要義，首先須弄清ImageJ圖像分析軟件中Smoothing的涵義。   

一、ImageJ用戶指南對關于Smoothing功能的說明

1.1 ImageJ用戶指南關于Smooth命令描述
       ［29.1 Smooth］：Blurs the active image or selection. This filter replaces each pixel with the average of its 3×3 neighborhood；
      ［29.11.5 Mean］：Smooths the current image by replacing each pixel with the neighborhood mean.
      【歸納起來，Smooth命令是一個用于對當前活動圖像或選區模糊處理的濾鏡功能。其模糊算法的原理是，將每個像素的強度值用其鄰近3×3區域內像素的平均值來取代。】
      ［29.14 Subtract Background］：For calculating the background (‘rolling the ball’), images are maximum filtered (3×3 pixels) to remove outliers such as dust and then smoothed to reduce noise (average over (3×3 pixels).
      【Smoothing命令用于采用滾球算法計算選區背景時，采用鄰近3×3像素區域的平局值替代該像素實際強度值的方法，濾除圖像中因灰塵、實驗背景等所致明顯高于周圍3×3像素范圍均值的異常像素，使圖像的背景過渡平緩。】
      Image J軟件主界面，當鼠標在當前激活的工作圖像掠過時，狀態欄會實時顯示鼠標所在位置像素的強度值（pixel intensities）和X-Y坐標值（coordinates）。
      如圖1所示，狀態欄同時顯示以鼠標當前所處像素為中心的左、右共三個像素B (x28,y16)、A(x29,y16)、C(x30,y16)的強度值。

       紅色標識的像素A(x29,y16)自身原始圖像強度值為129（本例為圖像灰度值）。
      按Smoothing算法，以像素A為中心，把其上、下左、右相鄰共9個像素圈選形成一選區（見圖2），區域內像素強度均值代表像素A的圖像強度值。
 

       圖2顯示，正方形活動選區共包括9個像素，強度均值Mean為131.4，即像素A的smoothing計算值。顯然，smoothing值大小會因A像素位置而異。

1.2 ImageJ指南關于Disable Smoothing選項設置的說明
       ImageJ指南同時暗示了圖像背景扣除條件并非必須采用Smooth一個算法。如背景扣除中確須禁用Smooth算法，則需勾選【Disable Smoothing】選項。
      Disable Smoothing的涵義與Smoothing正好相反。ImageJ指南關于Disable Smoothing有如下描述。
      ［29.14 Subtract Background］：With Disable Smoothing checked, the unmodified image data are used for creating the background.
      【如選中Disable Smoothing，則依照原始圖像數據而非濾鏡處理后圖像數據來創建選區背景。】
      Check this option to make sure that the image data after subtraction will never be below the background.
      【勾選Disable Smoothing選項，以確保扣除背景后的圖像數據不會低于背景信號強度。】

二、關于Smooth和Disable Smoothing算法涵義的疑問
       從指南以上關于Smooth和Disable Smoothing的介紹看，要完整清晰地理解Disable Smoothing算法還存在諸多疑點。這些問題的澄清，對在Western Blot條帶圖像分析中合理運用或禁用Smoothing算法，無疑具有積極意義。
       首先， Smoothing用3×3像素區域均值取代圖像中強度值異于鄰近像素的算法，實現削峰填坑。對于背景較為均勻的圖像，剔除個別、細小異常像素，無疑可確保圖像背景計算更合理。但Western Blot實驗條帶圖像中，背景均勻分布的理想狀態不多，而條帶邊緣與強度較高的大片背景區密切接觸、或條帶被背景帶斜穿的情形反而更常見。此時，采用Smoothing算法是否適用？
       其次，指南指出了采用Disable Smoothing算法可以確保扣除背景后的選區像素強度值不會低于背景信號強度。但前提必須是，選區邊緣部分像素信號強度要高于或等于背景像素，否則縱然有Disable Smoothing加持，減法做完后，邊緣像素有效信號也是“資不抵債”。這是否暗示：在基于圖像灰度值分析時，暗底白帶型Western Blot條帶圖像是DSM背景扣除算法的理想適用對象？
       最后，Western Blot條帶圖像分析中， Disable Smoothing和Smoothing兩種相反的背景扣除算法，其作用功效到底有何區別？是應該針對不同圖像背景條件可以按照“一帶一景”原則擇優錄取，還是二者只有一個算法是適用的？
      為解決以上疑點，我們通過實測，探究兩種算法在WB條帶蛋白豐度定量分析的實際表現和對分析結果的影響。

三、將Smoothing和Disable Smoothing算法運用于WB條帶分析實測
3.1測試目的和方法
      據《ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則》一文介紹的方法和流程，采用《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測》文中所用的有代表性的條帶信號-背景分布圖像，采用相同滾球半球，分別采用Smoothing（簡寫為SM）和Disable Smoothing（簡寫為DSM）背景扣除選項，測試引入兩種背景算法對圖像扣除的表觀效果和選區分析結果的影響。
      主要步驟和方法包括：
      (1)點 擊【process】→【Subtract Background】菜單，調出Subtract Background面板；
      (2) 勾選Create Background（don't sunbtract）生成SM組圖像背景，通過【Plot profile】命令，生成SM組背景信號曲線圖譜。
      (3) 在（1）步驟后，勾選Create Background + Disable Smoothing選項，生成DSM組圖像背景，再生成DSM組背景信號曲線圖譜。
      (4) 將SM組、DSM組圖像背景曲線圖疊加比較，結果證實，SM組背景曲線的起點和整體水平明顯高于DSM組曲線。

3.2 圖像表征情況的對比
      條帶1的ROI分別用SM、DSM兩種算法扣除背景后，圖像發生的變化見Fig.3。

      從圖3看，SM、DSM兩個測試組圖像的區別是：
      圖像ROI邊緣如圖3紅色標示區域，SM組圖像呈現出內外跨界、集中連片信號強度“消失”的景象（測試顯示，像素強度值為1-3范圍，肉眼難以辨識）。而DSM組選區內同等位置像素圖像強度下降但依然處于可視狀態。
      最關鍵的是，直觀觀察感知SM組的圖像整體亮度低于DSM組。而ImageJ的Meaure測試結果顯示，SM組Mean值、IntDen值分別為33、16435，而DSM組Mean值、IntDen值分別為35、17197；SM則測試值低于DSM組，這與肉眼辨識的結論一致。
      據Rolling ball算法原理，在滾球半徑相同情況下，相同ROI，SM組測試值低于DSM組，唯一合理的解釋便是：SM組的滾球起點更高而抬高運行軌跡整體水平，與信號強度曲線更近，造成了背景扣除程度更多保留信號更少所致。

      SM組測試值低，說明該算法所得的選區背景強度高于DSM組生成的背景。

       考慮到SM計算值因采樣像素所處周邊像素信號-背景條件格局不一而異。我們選擇常見的代表性條帶類型，進行進一步測試。

3.2.1 峰形完整型條帶

      β-actin-B1條帶的圖像信號分布曲線走勢平緩自然，圖像背景勻和，背景強度較低。

       背景扣除結果（Fig.6）顯示，SM算法生成的背景曲線起點和終點值均不僅明顯高于DSM組的背景曲線起止點信號值，并且曲線軌跡整體與DSM組軌跡分離。

3.2.2 背景穩定型條帶

      Clarity Max-B3條帶背景強度較高，條帶信號峰左右兩翼有拐點，末段均呈現平緩、平直走勢。綜合圖像背景分布情況，把像素列1-14設定分析選區。

      結果（見Fig.7）顯示，SM組背景信號曲線最低點在末端，該值與DSM組曲線的起點幾乎處于同一高度。

3.2.3信號中等背景強勢型條帶

      Clarity Max-B5條帶的特點是信號主峰兩翼均有拐點，拐點外圍信號曲線呈現反彈上揚走勢。未經甑別而以演示測試為目的，以拐點為界設置ROI，出現選區外背景信號高于選區邊緣信號的情況。

      Clarity Max-B5測試結果（見Fig.8）顯示，SM組背景信號曲線末端最低點信號值，都高于DSM組曲線的起點強度值。

3.2.4 信號弱背景強勢型條帶

      Clarity Max-B9這樣條帶整體特點是，圖像信號弱而背景強，條帶走勢不規則，曲線折點處像素信號明顯低于折點外圍，ROI邊界判別充滿挑戰。

      以測試為目的，對這一類條帶暫以這點為界設立分析選區。背景扣除結果，類似于Fig.8。SM組曲線走勢明顯高于DSM組。

      測試進一步證實，SM算法生成的選區背景強度整體上高于DSM組算法背景。當選區外圖像背景強度高于選區內圖像信號時，SM算法生成的背景曲線將明顯高于DSM算法所得曲線。
      基于有限的測試結果得出的初步結論是：在暗底白帶型Western Blot圖像條帶分析中，SM算法的選區分析值低于DSM算法測試值。

四、討論
       誠如《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測》指出的那樣，在CCD結合ECL化學發光檢測技術應用于直接Western Blot實驗檢測日益普及的現狀下，采用圖像的灰度值，直接對暗底白帶型原圖構建選區進行條帶定量分析，被證實是合理可行的方法之一。
      以上測試和此前類似大量實測都觀察到，在ImageJ軟件Subtract Background設置面板中，Disable Smoothing選項與背景扣除滾球半徑，是對選區分析值產生巨大影響的兩個關鍵控制條件。因此，其設置與否，在分析中不可忽視。即便不影響實驗分組間顯著性差異結論的做出，它也會在事實上影響了分析數據的準確性，改變組間量化對比關系。
      Subtract Background的圖像背景校正的默認設置是Smoothing算法。而基于目前經驗，在對暗底白帶型WB條帶圖像的分析中，Disable Smoothing算法引入的分析值高于Smoothing算法測試值。
      按Smoothing算法規則，在計算特定選區圖像背景值時，軟件是將選區邊緣兩列像素背景理論值與選區外的第一1列圖像初始強度值平均后作為選區背景計算的起止點。計算的結果，從測試結果看是背景值明顯抬升，有效信號強度自然會被削弱。特別是當我們遵循《ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則》，認定選框外為圖像背景的基礎上，后續對據此建立的分析選區采用Smoothing算法對背景扣除加碼，顯然是不合理的。
      基于實測，我們分析，ImageJ軟件默認的Smoothing算法并非WB條帶定量分析的必然選項。相反，我們的經驗證實，Disable Smoothing算法用于暗底白帶型WB實驗圖像的條帶分析，不僅可行，且數據準確性更高。
      實際工作中，由于Western Blot實驗操作和實驗條件的系統性問題，當實驗圖像背景復雜，條帶外形不規律等，造成選區創建中難以準確有效界定選區邊界的情況，確認ROI選區內仍殘留有背景成份的情況下，采用Smoothing算法，作為彌補單純采用ROI設置排除背景缺陷的補充手段，應有助于消除選區背景的干擾。因此，應用于實驗數據的初步評估有一定參考價值。

參考文獻
    ［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)
    ［2］在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測(上)