讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-7

      《 Western Blot條帶分析中如何計算ImageJ的滾球半徑？》提出，ImageJ軟件Subtract Background設置面板中的Sliding Paraboloid和Disable Smoothing兩個選項的設置，對Western Blot條帶圖像定量分析數據可靠、精準十分重要。
       本文嘗試探索Sliding Paraboloid算法的涵義，為其在Western Blot條帶蛋白定量分析中的合理運用提供理論依據。

一、關于Sliding Paraboloid算法涵義的理解

       關于Sliding Paraboloid選項，ImageJ用戶指南有如下描述：
       if checked, the ‘rolling ball’ is replaced by a paraboloid that has the same curvature at the apex as a ball of that radius.
       Nevertheless, the ‘sliding paraboloid’ is also an approximation, since it does not use a in fact paraboloid but it rather slides parabolae in different directions over the image.
       ［備注：在進行圖像背景扣除條件的設置時，勾選Sliding Paraboloid選項后，軟件將把該圓球半徑應用于軌跡頂點弧線曲率半徑，構建平滑的拋物線模型取代圓球模型，把虛擬拋物線軌跡縱橫方向上所觸及的信號強度范圍通通視為背景，從圖像原始像素強度值中予以扣除。］
       The ‘sliding paraboloid’ typically produces more reliable corrections since the ‘rolling ball’, a legacy algorithm (only kept for backward compatibility), is prone to edge artifacts.
       ［備注：平滑拋物線模型比經典圓球模型具有更可靠的背景校正效果。原因是經典圓球對剔除選區信號主峰兩翼邊緣末段部分背景時，容易殘留背景信號（artifacts）。］
       指南目前，關于sliding paraboloid亟需澄清的關鍵問題包括：
       首先，edge artifacts到底是指什么，為何rolling ball經典算法存在edge artifacts的問題，而sliding paraboloid則可以有效克服？
       其次，sliding paraboloid既被視為rolling ball的迭代算法，它是否適用于Western Blot條帶定量分析的背景扣除？
       再次， 軟件虛擬的平滑拋物線到底是平拋線，還是彈道拋線線？
       最后，引入sliding paraboloid算法設置，到底對Western Blot條帶定量分析結果有何影響？

       我們引用《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測-上》的一組實測結果，來逐一探究以上問題。

二、sliding paraboloid在Western Blot條帶定量分析中的作用實測

       分析方法：對Clarity Max組Western Blot實驗的條帶2建立ROI（規定為初始值Raw組），采用軟件默認smoothing設置（規定為SM組）、smoothing疊加sliding paraboloid（SP）設置的（規定為SM+SP組），分別進行背景扣除，調用【Plot Profile】功能和【Measure】，觀察組間選區圖像有效信號強度分布、圖像背景強度分布和分析統計結果的區別。

2.1 選區圖像有效信號強度分布曲線變化

       圖1是背景扣除前該Western Blot條帶選區的圖像信號強度分布的峰形圖。圖中可見，主峰左右兩側圖像背景存在落差，信號走勢曲線兩翼的末段長而低平。從選區右側邊緣第13列像素開始，曲線突現轉為低平，有明顯拐點。

       從外形上分析，規整的圓球弧線難以與曲線末端良好接觸，很可能第14列像素的背景扣除失真、失效的情況。

       圖2是顯示，經默認smoothing算法疊加經典Rolling ball算法生成背景并扣除后，信號主峰右翼邊緣曲線出現“斷裂”的痕跡，實際是曲線下限低于參考背景“地平線”而淹沒在參考線一下所致。

       說明采用smoothing算法，使靠近處于選區外圍的第14像素列信號強度高出處于選區內側第13列像素信號強度的異常情況。

       圖3是經默認smoothing算法疊加sliding paraboloid算法修正背景后，選區圖像信號強度分布形勢。結果顯示，信號曲線末段，即選區內第14列像素信號曲線淹沒于“參考地平線”以下。說明該算法扣除背景后，選區外圍圖像信號強度低于內側像素的強度值，情況正常。 

       用Plot profile在對出現信號淹沒的選區13-14列像素范圍局部放大，發現SM組和SM+SP組，峰形曲線末段走勢截然不同：圖4顯示的是SM組末端上楊，而圖5則顯示，SM+SP組的末端呈下行走勢。

       根據條帶信號強度分布一般規律和滾球背景扣除原理，ROI圖像有效信號強度理應離ROI中心越遠信號越弱，直至消失。據此判斷，SM背景扣除方案對于該ROI選區不適用，而SM+SP設置方案則合理可行。

2.2 選區測試結果

       采用實測中條帶1、條帶2和條帶6共3個條帶的測試值，下表按順序分別列出了各條帶初始值、SM組和SM+SP組的測試值。

表1  WB條帶SM和SM+SP組分析數據列表

       從測試結果看，所有條帶，無論是SM組和SM+SP組，所建立的分析選區ROI的Min值均為0，背景扣除無明顯異常，符合《ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則》的要求。
       所有條帶的IntDen值，加入sliding paraboloid選項后，SM+SP組與SM組相比會升高。以條帶3IntDen值為例，SM+SP組比SM組升高幅度達5.5%。

2.3 選區圖像背景信號分布曲線

       ImageJ軟件的rolling ball經典算法和sliding paraboloid，針對同一個分析選區計算后生成的圖像背景有何區別？

2.3.1經典rolling ball算法生成的選區背景

       圖6的信息顯示，滾球算法生成的背景首、尾兩端信號強度點分別為109.0 - 100.9。背景剖面類似于平拋線。
2.3.2 sliding paraboloid算法生成的選區背景

       圖7顯示，sliding paraboloid算法生成的選區背景首、尾兩端信號強度點分別為108.9 - 101.2。

       對比可知，生成的拋物線兩端落差略小，起點更低，止點高。提示，sliding paraboloid的末段離信號峰分布曲線更近，使得選區邊界像素的信號更多被去除）。

       把兩個背景剖名疊加后可以看出：sliding paraboloid背景頂部呈現的曲線整體走勢更平緩，起點和中部更低平，曲線末段斜率略微減小；曲線以下空間（背景）小于滾球曲線。通俗地概括sliding paraboloid背景曲線特點就是，低頭尾巴放低身段增信號。
       下面的圖例源自此前Western blot條帶圖像實測分析中ImageJ軟件平滑拋物線算法生成的其他圖像背景信號分布曲線，具有一定的代表性，可以有助于將sliding paraboloid算法邏輯理解的形象化。

       從這些采用sliding paraboloid算法的Western Blot條帶圖像分析結果看，推測ImageJ軟件會根據設定的ROI條件和sliding paraboloid設置，自動調整優化拋物線的位置，以便與圖像信號曲線走勢實現最優的匹配。

三、討論

        因Western Blot實驗中條帶形狀、信號強弱以及周圍背景條件不一，使得條帶分析選區圖像信號強度分布Plot圖千姿百態。 ImageJ圖像分析軟件所用的背景扣除圓球弧線和平滑拋物線算法，自身曲線走勢特征，與條帶ROI選區內邊緣圖像信號強度曲線之間的匹配程度存在區別。而信號曲線與背景扣除曲線之間距離大小，決定了圖像信號中被去除與保留的程度不一。造成了兩種算法對圖像分析選區邊界像素的背景扣除效果的區別。
       按照rolling ball算法原理，經典圓球對選區內部處于超長低平信號地帶的像素背景扣除少而保留信號多，使得在背景扣除后，圖像上ROI最外圍像素呈現出異常升高，在Plot圖上表現為曲線末段出現不連續（斷裂）和末端抬頭上翹現象，這無疑有悖常理。分析認為，這部分無法被滾球有效消除的殘余背景信號，即是ImageJ指南中所謂的edge artifacts。我們稱之為rolling ball算法的“邊緣效應”。可預見的是，主峰兩翼曲線末段越長、走勢越低平，圓球背景扣除效果越差。
       而平滑拋物線末段比同等半徑的圓弧線平直，使拋物線更有機會貼近強度信號曲線的末端，對于帶有明顯拐點的低平末段曲線匹配更好，因此對消除圖像選區信號微弱的邊界像素背景，有更好表現。我們把這種現象稱之為Sliding Paraboloid算法的“邊緣優化效應”。

       基于有限實測經驗和數據可觀察到，對暗底白條型Western Blot實驗圖像條帶定量分析中，Sliding Paraboloid算法引入，往往會拉高ROI的強度積分值，還經常出現ROI的Min值大于0的情況。而大多數的條帶，即便擁有低平信號末段的選區， rolling ball也可以實現背景扣除目的。因此，Sliding Paraboloid選項不是萬能的，也非剛需。

       我們認為，Sliding Paraboloid選項在Western Blot實驗條帶定量分析背景扣除設置中，典型適用指征為：當選區圖像強度主峰的邊緣部分強度信號急劇衰減，Plot圖上曲線急轉低平并于出現明顯拐點，可考慮采用平滑拋物線算法以便更有效地去除邊緣像素的背景。
       我們建議：在評估ROI曲線走勢和條帶選區邊緣背景基礎值，確認末段曲線難以與圓球曲線匹配，且經Sliding Paraboloid算法修正后的圖像信號曲線走勢合理，則應該優先考慮Sliding Paraboloid算法的分析數據。

參考文獻

［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)