讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-6

      《Western Blot條帶定量如何確定ImageJ滾球半徑？》提出，在WB圖像條帶定量分析中，扣除背景滾球半徑值由條帶短軸方向圖像有效強(qiáng)度信號(hào)的分布范圍大小決定。
       根據(jù)《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》提出的條帶分析選區(qū)創(chuàng)建規(guī)則，ROI正是基于條帶短軸方向圖像信號(hào)分布范圍來確定邊界的，即ROI的寬度值等于條帶短軸方向圖像強(qiáng)度信號(hào)分布的范圍。
       現(xiàn)在的問題：滾球半徑是否就等于條帶選區(qū)寬度值？
       要回答這個(gè)問題，還得從Rolling Ball算法原理和Rolling Ball Radius涵義說起。

一、準(zhǔn)確理解Rolling Ball算法和滾球半徑涵義

      《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》文中指出，在Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像分析中，扣除背景的滾球半徑小，圖像信號(hào)強(qiáng)度被當(dāng)作背景成份扣除的多。當(dāng)半徑縮小至不合理水平后，條帶因大量有效信號(hào)強(qiáng)度被去除失，會(huì)大幅降低ROI統(tǒng)計(jì)值。而滾球半徑增大，滾球與信號(hào)強(qiáng)度峰相切切除減少，峰中被保留的信號(hào)強(qiáng)度多，條帶ROI統(tǒng)計(jì)值增加。但滾球半徑進(jìn)一步放大后，各條帶檢測(cè)值中背景“水份”劇增，滾球扣除背景效果弱化甚至失去作用。

       既然rolling ball理論提出源于自然現(xiàn)象，滾球半徑設(shè)計(jì)也應(yīng)符合基本自然規(guī)律，確保其合理。

       先看一幅采用多個(gè)WB條帶Plot profile分析曲線圖經(jīng)裁剪、拼接、倒轉(zhuǎn)后合成演示圖（Fig. 2）。

       圖中3個(gè)信號(hào)峰，形態(tài)（峰度和偏度）各異，峰口邊緣“地形地勢(shì)”有別，各峰口跨度不一。三個(gè)滾球Rolling Ball -1，Rolling Ball-2和Rolling Ball-3，分別與Plot-1、Plot-2和Plot-3對(duì)應(yīng)。
       各滾球與峰口相應(yīng)的支撐點(diǎn)相切。按照滾球算法原理，A、B之間的范圍屬于有效信號(hào)范圍。從A、B切點(diǎn)各自向外側(cè)的信號(hào)曲線，皆視為圖像背景,不應(yīng)納入選區(qū)分析范圍。
       從圖上看，Plot 2有Rolling Ball-2a和Rolling Ball-2b兩個(gè)滾球。滾球2b半徑過小，球體深陷峰內(nèi)，且球體與峰口邊緣地形走勢(shì)并不匹配。反觀滾球2a，與峰接觸的圓弧與峰口外曲線的走勢(shì)較匹配。因此，從簡(jiǎn)單的自然規(guī)律角度，即可認(rèn)定滾球2a球體半徑尺寸較為合理。
       此時(shí)，弱采用比2a球體直徑更大的滾球經(jīng)過，則球-峰相切點(diǎn)位置會(huì)外移。此時(shí)，從2a滾球的角度看，更大球體的切點(diǎn)外移后，使原A、B外側(cè)的圖像背景被收羅進(jìn)入新選區(qū)。按ImageJ指南中滾球半徑是不包含圖像背景前提下的有效信號(hào)分布最大范圍尺度的規(guī)則，這明顯與“背景勿入”相悖。
       圖中的球-峰切點(diǎn)A、B之間連線，代表峰口直徑。不同峰口由于周圍“地形”條件不同，對(duì)與之匹配滾球的半徑尺寸要求理應(yīng)不同。峰口直徑越大，滾球半徑相應(yīng)也增大。

       在《Western Blot條帶分析中如何確定ImageJ滾球半徑？》已用實(shí)際案例證明，在實(shí)際工作中，脫離峰型實(shí)情，盲目套用50像素“神半徑”進(jìn)行背景扣除分析的做法，是不合理的。

       那么，在Western Blot條帶定量分析中，滾球半徑與選區(qū)寬度、峰口直徑三者之間有何關(guān)聯(lián)？

二、Rolling Ball、ROI寬度和峰口直徑三者間幾何學(xué)邏輯關(guān)系

      將實(shí)測(cè)采用實(shí)際WB條帶ROI的Plot Profile圖垂直翻轉(zhuǎn)后合成圖4，有助于直觀了解滾球半徑與選區(qū)寬度、峰口直徑三者之間的內(nèi)在聯(lián)系。
      A、B兩點(diǎn)為峰-滾球的兩個(gè)切點(diǎn)。分別經(jīng)過A、B引出圖像橫坐標(biāo)軸和縱坐標(biāo)軸的垂線后，兩條垂直線相較于C點(diǎn)，則A、C、B三點(diǎn)夠成一個(gè)直角三角形。三角形斜邊AB長(zhǎng)度代表峰口直徑。CB對(duì)應(yīng)信號(hào)峰的水平分布范圍，即ROI寬度。
      過AB中點(diǎn)M做AB垂直平分線，并任取O代表滾球圓心。則OA即該滾球的半徑R,MO與OA夾角為θ。 

      滾球半徑R與峰口直徑AB的計(jì)算公式為：

       圖4和計(jì)算公式表明，AB長(zhǎng)度確定的情況下，O下移至M點(diǎn)，此時(shí)θ為90°，滾球直徑剛好等于AB時(shí)，滾球作用毫無意義；
       圓心O外移，滾球半徑增大，球體于峰內(nèi)的弧線趨于平直，峰-球交集減少，峰內(nèi)保留的有效信號(hào)強(qiáng)度增多。當(dāng)滾球半徑增長(zhǎng)超出極限，圓弧線與接近AB線段無限接近，背景扣除部分劇減，去背景效應(yīng)幾近于詢價(jià)，同樣毫無意義。
      因此，R取值范圍并非存粹的數(shù)學(xué)計(jì)算問題，它是有“存在合理性”限制范圍的。超出此范圍后，滾球會(huì)失去應(yīng)用價(jià)值和存在的必要。
      按ImageJ指南描述內(nèi)容，滾球半徑R取值（“經(jīng)驗(yàn)值”）范圍是R≥AB。
      而基于直角三角形邊長(zhǎng)計(jì)算公式，滾球半徑R≥CB。
      這就從原理上回答了本文開頭部分提出的問題，即：滾球半徑不應(yīng)低于ROI寬度；它可以等于峰口直徑。
      此外，從圖上看，幾何知識(shí)還給了我們?nèi)缦掠袃r(jià)值的啟示：
      1）峰口直徑長(zhǎng)度（AB）不僅與選區(qū)寬度（CB）有關(guān)，還與AB兩點(diǎn)高程落差（AC）有關(guān)。
      2）AB的高程差，在Western Blot條帶圖像中，代表的涵義是條帶短軸方向上圖像背景信號(hào)強(qiáng)度差異。
      相同寬度的條帶，如選區(qū)ROI兩側(cè)背景強(qiáng)度落差不同，導(dǎo)致AB長(zhǎng)度有區(qū)別，進(jìn)而使?jié)L球半徑也發(fā)生改變（Fig. 2-1）。

      此外，當(dāng)ROI兩側(cè)圖像背景強(qiáng)度落差小時(shí)或落差極小，意味著條帶背景分布極其均勻，此時(shí)AB將無限接近CB，使得滾球半徑實(shí)際上接近于ROI寬度。根據(jù)公式計(jì)算的AB值等于CB值的現(xiàn)象，在WB條帶實(shí)測(cè)中確實(shí)屢見不鮮。

      AB高程差與AB長(zhǎng)度之間的有趣現(xiàn)象，再次驗(yàn)證了《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》和《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測(cè)》文中的觀點(diǎn)，即：滾球半徑不僅由帶條本身信號(hào)分布范圍尺度決定，同時(shí)還受到條帶選區(qū)所處圖像背景分布條件限制。
      因此，在WB條帶蛋白定量分析過程中，不同條帶應(yīng)采用“一帶一景”分析法則。而所謂網(wǎng)紅半徑，是不切實(shí)際的想法。

三、Western Blot條帶定量分析中滾球半徑測(cè)算方法

       實(shí)測(cè)中，我們采用直線工具法測(cè)算Rolling Ball半徑值。即借助于ImageJ軟件的直線工具length，直接測(cè)量AB長(zhǎng)度值。
       在Plot profile結(jié)果顯示窗口中，選擇工具欄的直線選區(qū)工具，以A為起點(diǎn)像B引出直線，工具欄下部會(huì)適時(shí)顯示鼠標(biāo)所在位置對(duì)應(yīng)線段的長(zhǎng)度值。
       當(dāng)鼠標(biāo)移到B點(diǎn)時(shí)，請(qǐng)注意用鍵盤截屏功能，截屏保存軟件測(cè)得的AB長(zhǎng)度值。 

       如圖Fig.5a所示，測(cè)得AB長(zhǎng)度為9.50像素。

       該方法操作直觀簡(jiǎn)便，測(cè)量精度控制要點(diǎn)在于確保直線工具的起止點(diǎn)與曲線首位兩端的高度重合。為此，可以將Plot profile顯示窗口拉大，這樣便于識(shí)別鼠標(biāo)中心與曲線末端的對(duì)準(zhǔn)程度。

       但該方法缺陷是測(cè)算結(jié)果人為誤差較大。引出的AB線段操作中，受電腦屏幕分辨率和屏幕大小、手工操作定位精準(zhǔn)度影響，操作過程測(cè)量精度的控制有一定難度。因而不同場(chǎng)次操作中，ROI的統(tǒng)計(jì)數(shù)值往往存在小幅波動(dòng)。

四、結(jié)語

      因條件所限，目前還無法對(duì)《Biomedical image processing》的rolling ball algorithm理論方法作詳盡研究，加之ImageJ圖像分析軟件應(yīng)用于Western Blot條帶定量分析的經(jīng)驗(yàn)尚缺，目前提出的Rolling ball半徑計(jì)算方法有效性還有待進(jìn)一步檢驗(yàn)。

      滾球半徑尺寸要基于具體的ROI計(jì)算。每個(gè)條帶短軸方向的形態(tài)、背景分布存在區(qū)別，滾球半徑計(jì)算值必然存在差異。這正是《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》所提的一“徑”難求的道理。

       “一帶一景”分析策略，更適合應(yīng)用于精確定量型Western Blot圖像分析。因此，滾球半徑不是經(jīng)驗(yàn)值，是具體條帶具體計(jì)算的親測(cè)值。采用不切實(shí)際的統(tǒng)一滾球半徑用于分析，無異于緣木求魚，不僅有悖于ImageJ指南中提出滾球半徑設(shè)定要求，甚至還將數(shù)據(jù)分析結(jié)果引入歧途。 

       至于本文開頭部分提出的問題，總結(jié)的話就是：滾球半徑值多數(shù)情況下等于信號(hào)峰的峰口直徑二大于選區(qū)寬度值；只有當(dāng)條帶短軸方向的前、后緣圖像背景均勻一致且強(qiáng)度落差很小時(shí)，峰口直徑或滾球半徑測(cè)算只等于條帶寬度。

     《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》提出ROI科學(xué)合理創(chuàng)建是分析工作成功的基礎(chǔ)。原因就在于ROI創(chuàng)建后，條帶分布范圍、峰口形狀都已界定，滾球半徑值是木已成舟，呼之欲出。依托ROI計(jì)算Rolling ball半徑，可以有效降低主觀隨意性和誤差。

      需指出，僅掌握滾球半徑算法，對(duì)于Western Blot圖像條帶定量分析還不夠。細(xì)心的讀者或許已經(jīng)注意到，在《圖像灰度值在Western Blot條帶定量分析中應(yīng)用的實(shí)測(cè)-上》一文中，實(shí)施“一帶一景”時(shí)，不同WB條帶的分析選區(qū)除采用差異化的滾球半徑值，還存在sliding paraboloid和Disable Smooth兩個(gè)選項(xiàng)引入與否的問題。

      如何為Subtract Background有效設(shè)置sliding paraboloid和Disable Smooth選項(xiàng)問題，留待《ImageJ軟件中Sliding Paraboloid的涵義及在WB條帶分析中的應(yīng)用初探》和《ImageJ軟件Smoothing算法的涵義及在Western Blot條帶定量中運(yùn)用初探》來討論。

參考文獻(xiàn)

［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)