讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-5

      《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》提出，用ImageJ圖像分析軟件對Western Blot條帶定量分析中，背景扣除用的滾球半徑值設(shè)置的科學(xué)合理對分析結(jié)果產(chǎn)生重要影響。而半徑設(shè)置應(yīng)根據(jù)被分析對象在圖像中的范圍尺寸進(jìn)行。

       本文從Western Blot條帶圖像信號分布的固有特征出發(fā)，來探討基于條帶短軸方向像素強度分布范圍大小來確定Rolling ball半徑方法的理論依據(jù)和在WB條帶定量分析中應(yīng)用可行性。

一、Westen Blot條帶圖像信號分布范圍決定著條帶強度分析結(jié)果

1.1 Western Blot實驗條帶的長軸長度較穩(wěn)定
       Western Blot實驗操作繁瑣且環(huán)節(jié)眾多，極大影響著實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

       眾所周知，實驗條件（Buffer配方、工作溫度及pH值等）、試劑耗材品質(zhì)和具體操作細(xì)節(jié)上的人為差異，以及蛋白分子自身水溶性、等電點、分子量、表達(dá)水平等屬性存在區(qū)別，造成不同實驗室間、不同實驗批次間WB條帶圖像存在很大區(qū)別。

       如條件許可，改進(jìn)實驗硬件配置和自動化程度，積極優(yōu)化操作流程，無疑有助于提高WB實驗結(jié)果的穩(wěn)定和可靠性。譬如，如蛋白凝膠電泳用伯樂Mini-Protean Tetra蛋白垂直電泳槽，電泳梳統(tǒng)一為10孔10.mm或15孔1.0mm（可穩(wěn)定電泳條帶形態(tài)長度和蛋白初始載量）,轉(zhuǎn)膜就來Mini-Trans Blot小型電轉(zhuǎn)印槽或用帶內(nèi)置程序的Trans-Blot Turbo蛋白快速轉(zhuǎn)印儀（穩(wěn)定轉(zhuǎn)膜條件和效果），抗原抗體免疫雜交按Merck Western Blotting檢測加速器SNAP i.d. 2.0等預(yù)置程序進(jìn)行（穩(wěn)定檢測條件和效果）,曝光成像統(tǒng)一為CCD分辨率910萬像素的英捷iBright CL系列化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)或630萬像素的伯樂ChemiDoc Western ECL化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)，采用優(yōu)化的曝光設(shè)置（確保檢測靈敏度、圖像分辨率與條帶尺寸一致）等。

       Western Blot實驗采用相同實驗條件和流程，排除轉(zhuǎn)印等操作失誤因素后，同一批次實驗，10孔SDS-PAGE凝膠獲得的Blot，條帶長度差異不過1～4個像素。
       實測經(jīng)驗表明，條帶分析選區(qū)的長軸適度延長1-3個像素，對ROI面積和IntDen值影響忒微。條帶長軸長度并非Western Blot條帶測試值的關(guān)鍵影響因素。

1.2 Western Blot實驗條帶的短軸方向分布具有條帶特異性
       通常情況下，Western Blot實驗圖像上，條帶亮度強度分布規(guī)律是從條帶長軸中心順著短軸一前、一后兩個方向擴散分布并漸次減弱，直至淹沒于條帶背景中。

       經(jīng)驗告訴我們，條帶寬度，會因蛋白表達(dá)豐度而存在顯著區(qū)別。一般說來，電泳蛋白初始載量大，對應(yīng)條帶圖像不僅亮度高，條帶也寬。反之，圖像中弱信號條帶，往往伴隨條帶寬度的明顯縮窄。

       為Western Blot圖像條帶創(chuàng)建分析選區(qū)中可發(fā)現(xiàn)，各條在帶短軸方向強度信號分布范圍的哪怕僅1個像素列的差別，會使ROI選區(qū)的像素數(shù)量（Area值）以數(shù)十的幅度猛增，而IntDen值則以千量級急劇放大。這就很好地解釋了，肉眼看似條帶差別不大，但統(tǒng)計結(jié)果差異懸殊的常見現(xiàn)象。
       可見，條帶短軸長度與ROI的Area值和IntDen值均存在顯著正向關(guān)聯(lián)。
       說明，是Westen Blot條帶短軸方向圖像強度信號分布范圍大小，左右著條帶統(tǒng)計分析結(jié)果。   

       故應(yīng)遵循電泳實驗客觀規(guī)律，抓準(zhǔn)真正影響分析結(jié)果的牛鼻子。

       根據(jù)《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》的觀點，Western Blot圖像條帶分析選區(qū)的背景扣除算法中Rolling ball滾球半徑值，應(yīng)當(dāng)按照分析對象在圖像中的分布范圍大小來確定。

      顯然，條帶圖像強度信號在短軸方向的分布范圍，正是Rolling ball滾球半徑值設(shè)定的首選參考標(biāo)準(zhǔn)。

二、基于條帶短軸信號分布范圍建立條帶分析選區(qū)方法的實測驗證

       實測目的是嘗試解決以下三個問題：

       90°旋轉(zhuǎn)后，是否會影響圖像ROI的IntDen值？

       分別依照條帶短軸和長軸模式創(chuàng)建ROI，分析結(jié)果是否存在差異？

       按短軸模式建立的ROI背景扣除設(shè)置是否可以移植到傳統(tǒng)長軸分析模式中？

2.1 圖片來源

       2020年發(fā)表于NATURE COMMUNICATIONS的ARTICLE《CLR01 protects dopaminergic neurons in vitro and in mouse models of Parkinson’s disease》中PGC1α的Western blotting實驗圖像，保存為.bmp格式。

2.2 圖像處理準(zhǔn)備

      1）通過反相處理，所得圖像為條帶長軸分析模式；

      2）反相后再進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)90°處理后用作條帶短軸分析模式；

      兩幅處理后生成的新圖分別保存為.tif格式備用。

2.3 圖像ROI創(chuàng)建

      按《如何用ImageJ在Western Blot條帶定量分析中創(chuàng)建分析選區(qū)》所述方法，依次實施條帶ROI邊界評估→創(chuàng)建ROI→保存ROI方案操作。

      本次在條帶長軸、短軸兩種分析模式下創(chuàng)建的兩個ROI設(shè)置和分析條件見表1。

表1  條帶長軸、短軸分析模式建立的ROI情況

2.4 ImageJ的Plot Profile分析

      依據(jù)條帶短軸和長軸分析模式建立的兩個ROI，實際是位置、大小完全的同一個選區(qū)。在同一個分析界面分別執(zhí)行Measure→Plot profile，結(jié)果如fig. 4所示。

      Plot分析顯示，采用短軸模式ROI的條帶強度值分布呈現(xiàn)近似于高斯模型，灰度值范圍為93-122。而長軸模式ROI強度值為不規(guī)則峰形，灰度值范圍為88-114。

2.5 軟件分析結(jié)果

      兩個模式創(chuàng)建的ROI，分別執(zhí)行Measure命令后，在同一個分析界面顯示的IntDen值完全一致。提示，用ImageJ將圖像旋轉(zhuǎn)90°處理，相同ROI，IntDen信號值未見顯著變化。

      將長軸與短軸兩種分析模式的ROI，分別扣除背景后，執(zhí)行measure命令后，結(jié)果如fig. 6所示。

      結(jié)果表明，兩種模式的ROI，采用不同背景校正設(shè)置后，IntDen有效計算值相差極為懸殊。短軸模式ROI IntDen值為42589，長軸模式ROI IntDen值為48629.，前者僅后者的87.5%，差異顯著。

      對長軸模式ROI分別采用長軸模式、短軸模式、混合模式的背景扣除方法，進(jìn)一步對長軸ROI分析，結(jié)果見fig. 7。

      結(jié)果顯示：

      1）長軸模式ROI，用長軸背景扣除法、短軸半徑+長軸背景設(shè)置、短軸背景扣除法校正背景后，IntDen計算值分別為48629、10127、42589；

      2）長軸ROI模式按照自身Plot分布形態(tài)設(shè)計的背景扣除設(shè)置方案，所得數(shù)據(jù)明顯大于短軸模式ROI測試值和在長軸ROI上用短軸ROI分析模式背景扣除方案的結(jié)果；

      3）長軸分析模式ROI，采用跟短軸分析模式完全一致的背景扣除設(shè)置，軟件計算結(jié)果完全等效于短軸分析模式所得結(jié)果。

2.6  驗證結(jié)論

       基于條帶短軸信號分布創(chuàng)建分析選區(qū)ROI、計算ROI匹配的背景扣除滾球半徑，運用于實例的檢驗測試說明：

       1）測試圖像經(jīng)90°旋轉(zhuǎn)處理，未對ROI分析值產(chǎn)生明顯影響；

       2）分別依照條帶短軸和長軸模式創(chuàng)建的ROI分析數(shù)據(jù)差異明顯，無可比性；

       3）按照短軸模式設(shè)計的ROI背景扣除設(shè)置，可以移植到長軸模式ROI。

       結(jié)果表明，原始圖像旋轉(zhuǎn)90°后，在條帶短軸模式下摸索出背景扣除設(shè)置方案，可直接照搬用于常規(guī)長軸模式下創(chuàng)建的ROI分析。

三、討論

      無論是實驗技術(shù)網(wǎng)絡(luò)論壇，還是期刊論文，在對Western Blot實驗圖像中條帶背景扣除方法技術(shù)細(xì)節(jié)上，大家一直惜墨如金。究其原因可能有很多：

       1）或許是因為有Bio-Rad Quantity One或Image Lab Software，GE ImageQuant TL，AlphaView Software和UVP LS Software等專業(yè)凝膠圖像分析軟件的加持，軟件內(nèi)置背景扣除功能破解了數(shù)據(jù)分析中這道難題且屢試不爽，背景對這部分實驗人員不算事；

       2）或許是Subtract Background這個環(huán)節(jié)太easy了，細(xì)節(jié)處理好壞，并不影響實驗組間數(shù)據(jù)的顯著差異，因而不屑一顧，故也就不足掛齒；

       3）背景扣除操作規(guī)則還缺少明文公約，操作過程主觀性極強，一言難盡。擔(dān)心過多討論沖淡主題，甚至引發(fā)對數(shù)據(jù)分析結(jié)論準(zhǔn)確性的質(zhì)疑。

       針對Western Blot圖像定量分析中背景校正環(huán)節(jié)滾球半徑的準(zhǔn)確理解運用的困境，我們基于ImageJ軟件和反復(fù)實測基礎(chǔ)上，提出Rolling Ball半徑應(yīng)基于具體條帶的強度信號沿短軸信號分布范圍的設(shè)計放法，借助于ImageJ的Plot profile分析模塊，以條帶強度值分布形態(tài)為基礎(chǔ)創(chuàng)建ROI，并據(jù)此確定Rolling Ball半徑。

      本文還進(jìn)一步證實：基于短軸模式下創(chuàng)立的ROI條帶背景扣除方案，可直接應(yīng)用于常規(guī)長軸模式下建立的ROI分析。前提是，兩種模式下建立的ROI位置、范圍和大小完全相同，以確保被分析的圖像像素完全一樣。此前《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實測》公開的數(shù)據(jù)，全部基于條帶短軸分析模式產(chǎn)生。此驗證測試結(jié)果，是對已發(fā)表結(jié)論的有力支持、完善和補充。這樣的益處顯而易見，有效避免了因擔(dān)憂圖像旋轉(zhuǎn)處理造成的圖像信息損失并因此引發(fā)的爭議與質(zhì)疑。

      創(chuàng)建ROI后如何計算Rolling ball的半徑值？請參考《Western Blot條帶分析中如何計算ImageJ的滾球半徑？》一文。

參考文獻(xiàn)：

   1. 在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實測(上、下)

   2. Quantity One Version 4.4 User Guide（4000126-14，RevA）