讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-4

  《 如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》一文探討用ImageJ軟件的Plot Profile分析功能創(chuàng)建ROI的具體操作方法。接下來(lái)，要把Western Blot條帶圖像ROI轉(zhuǎn)化成精準(zhǔn)數(shù)據(jù)，要邁過(guò)難關(guān)就是如何有效實(shí)施ROI的背景扣除。
      本文聚焦ImageJ圖像分析中Subtract Background所用的神器滾球Rolling ball，理解其校正圖像背景的原理基礎(chǔ)上，探討在Western Blot條帶定量分析中的如何有效運(yùn)用這一神器的問(wèn)題。
一、ImageJ中的rolling ball到底如何扣除背景？
      Rolling Ball,即Rolling disc，Rolling ball algorithm，Rolling ball background subtraction algorithm, rolling ball procedure,稱為滾球算法，滾球背景扣除算法, 由Sternberg Stanley在《Biomedical image processing》（IEEE Computer, Jan 1983)中首先提出，至今仍是醫(yī)學(xué)圖像處理中校正圖像背景或去除背景強(qiáng)度差異（remove background intensity variations）的著名程序工具。
      據(jù)網(wǎng)上公開(kāi)的斯坦利·斯特恩伯格《Biomedical image processing》原文部分內(nèi)容，Rolling ball algorithm理論模型如圖1所示。

      把數(shù)字圖像比作一幅3D地形圖，則地形中的任一點(diǎn)，相當(dāng)于一個(gè)像素，除具備X、Y經(jīng)緯坐標(biāo)，同時(shí)還有一定的海拔高度（相當(dāng)于圖像中像素強(qiáng)度）。 滾球算法理論，就是設(shè)想有一個(gè)圓球沿著3D圖像的“地表”下地形起伏而滾動(dòng)（rolled over the bottom side of this surface）。功效如同地鐵修建用盾構(gòu)機(jī)，滾球在滾動(dòng)中，把表面可觸及到地質(zhì)成份通通鑿去（the hull of the volume reachable by the ball is the background to be subtracted）。

      地形中某些像素聚集形成一定海拔高度的信號(hào)峰突出地表，而球體因直徑限制而卡嵌在“峰”的兩翼后，球體只接觸到峰的底部一定高度范圍。

       無(wú)論是峰內(nèi)還是峰外，凡球體之所及，通通削除。去除背景后的3D地表形態(tài)，狀如圖2中的喀什特地貌圖：一望無(wú)垠的平野，點(diǎn)綴著一座座千姿百態(tài)的孤峰。

       將整個(gè)三維地表來(lái)個(gè)扭轉(zhuǎn)乾坤后，依然是一個(gè)高低起伏的3D地貌。

       倒立的山峰，此時(shí)形同大小深淺不同的坑。圓球直徑過(guò)小的話，會(huì)直接掉入坑中。當(dāng)圓球半徑足夠大，因坑口支撐，球體僅有部分陷于坑中。 球越大則陷得越淺。

       峰口處箭頭所指為球-峰切點(diǎn)。切點(diǎn)間的圓弧線被視為是坑周圍地形自然延伸（相當(dāng)于圖像的背景），不視為坑的有效容積，需予剔除。切點(diǎn)弧線以下橙色區(qū)域，才算作坑的有效容積（相當(dāng)于圖像信號(hào)峰的有效強(qiáng)度值）。

       圓球陷入坑口部分的深度，取決于兩個(gè)關(guān)聯(lián)因素：

1）坑的跨度

       跨度越大，要求球體直徑相應(yīng)也大，否則大半球體深陷甚至沉沒(méi)于峰體中，造成峰切削過(guò)度；跨度小，則與之有效相切匹配的球體相應(yīng)也小。

2）球體直徑

       不同峰型，底部外形不一，跨度不同，與之匹配的圓球直徑也不同。

       與Photoshop對(duì)圖像調(diào)整僅局限于選區(qū)不同，滾球背景扣除算法中，圓球用逐行滾動(dòng)方法掃描圖像中每一個(gè)像素點(diǎn)。但凡暴露于”坑“外較平整處的像素，皆為球可觸及之所，該像素信號(hào)值予以清除。滾球無(wú)法觸及的像素，削去球體可達(dá)到部分信號(hào)后再被分析統(tǒng)計(jì)。由于每個(gè)選區(qū)通常包括數(shù)十行像素，軟件會(huì)將相同Y坐標(biāo)像素的像素按列為單位，將“殘余”像素強(qiáng)度值平均后予以呈現(xiàn)和統(tǒng)計(jì)。

       滾球半徑不同，滾球處理后，整幅圖像所得的像素強(qiáng)度也不同。對(duì)不不同的“坑”（信號(hào)峰），采用不同的滾球半徑處理，背景扣除后的統(tǒng)計(jì)值存在區(qū)別。

       實(shí)測(cè)也表明，同一個(gè)圖像副本，相同ROI設(shè)置，采用軟件默認(rèn)的50像素滾球半徑設(shè)置，最后的分析值與實(shí)測(cè)中優(yōu)化的半徑值差距可謂天然之別。以《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測(cè)-上》中所用的條帶1、5為例，采用實(shí)測(cè)優(yōu)化滾球半徑的分析值分別為17799、3557，而采用50個(gè)像素滾球半徑的分析值為20991、6502。經(jīng)兩種半徑處理后，條帶1和5的比值0.200 VS 0.310。分析結(jié)果徹底偏離了實(shí)驗(yàn)中條帶蛋白原始含量的對(duì)比關(guān)系。

      不同條帶，由于條帶強(qiáng)度信號(hào)分布的差異，導(dǎo)致峰型各異，與之匹配的背景扣除滾球半徑值，必然有所區(qū)別。這正是前文《實(shí)測(cè)》所提及的一（條）帶一（背）景的的理論依據(jù)。

二、對(duì)ImageJ指南中rolling ball半徑設(shè)定方法描述的解讀
      關(guān)于圖像背景扣除用滾球半徑設(shè)定，ImageJ指南做了如下說(shuō)明：
      【As a rule of thumb, for 8–bit or RGB images it should be at least as large as the radius of the largest object in the image that is not part of the background. Larger values will also work unless the background of the image is too uneven. 】
      根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于8位或RGB圖像，滾球半徑應(yīng)該不低于圖像中最大分析目標(biāo)的外形半徑。在圖像背景較均勻的情況下，設(shè)定半徑大于分析目標(biāo)尺寸半徑亦可。但如果圖像背景太不均勻，半徑大并不好。
      【For 16-bit and 32-bit images with pixel value ranges different from 0～255, the radius should be inversely proportional to the pixel value range (e.g., for 16-bit images，pixel values 0～65535, typical values of the radius are around 0.2 to 5).】
      對(duì)于16位和32位圖像，圓球半徑應(yīng)與像素值范圍成反比。例如 16位圖像，像素灰度值范圍為0～65535，圓球半徑通常為0.2～5像素）。
      ImageJ指南中，采用8-bit黑白灰圖像做示例很普遍，但卻沒(méi)有如16位和32位圖像那樣，提供8-bit圖像圓球半徑的參考“經(jīng)驗(yàn)值”。但卻很容易讓人誤以為8位圖像應(yīng)該也有一個(gè)跟像素值成比例的半徑值。剛好，這段描述文字下引用了一幅圖用于演示圖像背景扣除前后背景變化的效果（見(jiàn)圖4）。 

       圖中的subtraction background設(shè)置面板窗口中，有個(gè)50.0 pixels的Rolling ball radius。
      作為指南，原本應(yīng)該對(duì)圖片的處、50像素半徑值的設(shè)置理由有個(gè)簡(jiǎn)單的標(biāo)注，卻只字未提。
      如果不加分析的話，可能部分人也會(huì)認(rèn)為：8位圖像的滾球半徑可能也與像素值成比例，該半徑值可能也類似于0.2～5像素那樣是一個(gè)很小范圍。而正是這樣一種預(yù)期心理，加上50像素大于16位圖像的5個(gè)像素。于是，這個(gè)來(lái)路不明的50像素半徑值，就這樣稀里糊涂地成為了ImageJ愛(ài)好者眼中的網(wǎng)紅。在某乎發(fā)表的教程中，就采用了這個(gè)備受矚目的50像素作為Western Blot條帶定量分析中扣除背景滾球的半徑值。
      目前，基于我們自身的大量實(shí)測(cè)經(jīng)驗(yàn)，可以認(rèn)為，Western Blot條帶定量分析中，不結(jié)合圖像具體情況，動(dòng)輒采用網(wǎng)紅半徑值的，大半都是錯(cuò)誤的。
      對(duì)ImageJ軟件指南中這段話寥寥數(shù)十個(gè)單詞應(yīng)該這樣來(lái)解讀是合理的：
      1）不同的8-bit圖像，如圖像背景平滑而連續(xù)（譬如電泳凝膠圖像等），則滾球半徑大于等于被分析對(duì)象的半徑。這個(gè)radius，可以理解為這個(gè)分析對(duì)象的幾何尺寸、半徑等，不能簡(jiǎn)單理解為這圓型的分析對(duì)象。
      2）正如《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》建議的那樣，分析選區(qū)劃定的重要原則就要是盡最大可能把被分析對(duì)象所屬全部像素收入ROI，同時(shí)盡可能地把屬于圖像背景的像素從分析選區(qū)中排除出去。了解這一規(guī)則后，“the largest object in the image that is not part of the background”可理解為，在不包含圖像背景的前提下被分析對(duì)象所能覆蓋的最大范圍。
      3）被分析對(duì)象類型不同，則其所能覆蓋的范圍、自身規(guī)格尺度會(huì)有差別，而對(duì)應(yīng)的滾球半徑也應(yīng)存在區(qū)別。不同實(shí)驗(yàn)類型，如熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品，核酸蛋白的凝膠電泳，Western Blot實(shí)驗(yàn)、菌體克隆計(jì)數(shù)，免疫組化病理切片等，獲取的實(shí)驗(yàn)圖像區(qū)別很大。被分析對(duì)象，如菌體、WB條帶、發(fā)射熒光的細(xì)胞，染色的組織團(tuán)塊等，在圖像上形成的斑點(diǎn)、區(qū)域的形態(tài)和圖像分布范圍各異，使得圖像處理用相應(yīng)滾球半徑必有差異。換句話說(shuō)，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)不同樣品、分析對(duì)象圖像特殊性來(lái)決定圖像背景扣除用的最佳滾球半徑，而非一個(gè)50像素應(yīng)用于所有類型圖像分析。
      4）同一個(gè)對(duì)象置，背景如果保持均勻，半徑略加大還可以。但若背景很不均衡、不連續(xù)，則增大滾球半徑，是無(wú)效的。
就是說(shuō)，即便分析對(duì)象一致，如圖像所處的背景條件不一致，則對(duì)應(yīng)的滾球半徑很可能不同。這暗示，滾球半徑值除了受分析對(duì)象尺寸范圍大小的限制，還受分析區(qū)域所處圖像背景情況制約。圖像背景不均衡不均勻的情況下，滾球半徑設(shè)定尺度會(huì)有變化。

三、Rolling ball合理設(shè)置對(duì)改進(jìn)Western Blot條帶定量分析數(shù)據(jù)質(zhì)量具有重要意義
      ImageJ軟件圖像背景扣除的采用的算法，一個(gè)是經(jīng)典Rolling Ball另一個(gè)就是平滑拋物線算法（Sliding Paraboloid Algorithm）。但拋物線頂點(diǎn)曲率半徑還沿用的是滾球的半徑（a paraboloid that has the same curvature at the apex as a ball of that radius）。因此，無(wú)論經(jīng)典Rolling Ball還是更精細(xì)sliding paraboloid算法進(jìn)行背景的扣除，滾球半徑值才是核心和關(guān)鍵。
      ImageJ軟件自投入應(yīng)用數(shù)十年來(lái)，被分析過(guò)的圖像和類型多得難以計(jì)數(shù)。然而，官方在歷次用戶指南更新中，不同類型圖像所適用的滾球半徑值參考方案，從未發(fā)布。退一步說(shuō)，授人以魚(yú)不如授人以漁。那怕總結(jié)出一套天下英豪應(yīng)用過(guò)程中對(duì)不同實(shí)驗(yàn)圖像的滾球半徑設(shè)定范例，也足以讓初學(xué)者受益匪淺。可惜，這個(gè)事情，即便是NIH，也難以滿足蕓蕓眾生的熱切期待。
      在Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像分析中，扣除ROI背景的滾球半徑的設(shè)置，到底參考什么radius或size，無(wú)論是ImageJ、UVP和Bio-Rad的軟件指南中，均無(wú)明確可供參考意見(jiàn)。
      事實(shí)上，背景扣除滾球半徑值的設(shè)置，對(duì)Western Blot圖像分條帶定量分析結(jié)果的影響巨大。滾球半徑設(shè)定不當(dāng)，輕則有損實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性，重則使實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估引入歧途。
      半徑越小，獲得的有效信號(hào)中的背景“水份”越小。不合理地縮小滾球半徑后，強(qiáng)信號(hào)條帶檢測(cè)值損失極為明顯。UVP在軟件操作指南也提到，過(guò)小滾球半徑會(huì)因“滾進(jìn)”條帶內(nèi)部而大量消除有效信號(hào)數(shù)據(jù)（An excessively small disc will "roll into" bands, eliminating the band data almost entirely）。
      隨著滾球半徑加大，各條帶檢測(cè)值均由小漸大。弱信號(hào)條帶和強(qiáng)背景干擾條帶檢測(cè)值飆升，說(shuō)明對(duì)扣除背景的作用弱化。當(dāng)半徑超過(guò)一定范圍，球體弧線由于太“平直”無(wú)法與測(cè)試曲線相切，徹底喪失去背景的作用。這一點(diǎn)ImageJ和UVP軟件指南的結(jié)論是一致的。這也驗(yàn)證了《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測(cè)-上》采用的“一帶一景”策略的必要性。

四、結(jié)語(yǔ)
      ImageJ指南雖然關(guān)于圖像背景扣除中滾球半徑設(shè)置方法缺少必要說(shuō)明。但是半徑設(shè)置的整體原則是要要求的，即：視不同分析對(duì)象而定，依圖像背景情況而定，半徑值相當(dāng)于被分析對(duì)象在圖像上的最大尺寸范圍。
      而Western Blot圖像條帶分析實(shí)測(cè)經(jīng)驗(yàn)，同一Blot中，不同條帶因外形和周圍背景條件有別，宜采用不同優(yōu)化半徑。 而不同批次的Western Blot圖像，因凝膠電泳和印跡雜交操作過(guò)程存在差異，即便采用同一個(gè)成像系統(tǒng)和完全相同成像曝光設(shè)置，背景扣除滾球半徑也是一“徑”難求。
      電泳凝膠和Western Blot圖像條帶定量分析中，扣除背景滾球半徑的設(shè)定時(shí)，到底參考什么尺寸才符合分析要求？此話題將在《Western Blot條帶分析中如何確定ImageJ滾球半徑？》中討論。

參考文獻(xiàn)
      1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4
      2. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)
      3. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)