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如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區
讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-3
ImageJ軟件用于Western Blot條帶定量分析，首先要創建分析選區（ROI）。選區既是框定了被分析對象圖像信號分布的范圍，也等于設定了圖像背景基線、確定了圖像背景扣除的滾球半徑。因此，科學合理的ROI創建，是條帶分析數據客觀有效、確保后續分析不偏離正常航向的燈塔。
為WB條帶建立ROI操作，可分為4個基本步驟：圖像準備，ROI邊界范圍評估，正式創建ROI和ROIs方案保存。
一、圖像的準備
因Western Blot實驗條件系統和操作者個人經驗技術等因素，WB實驗圖像的條帶位置排列難以整齊劃一，往往傾斜，形如翹板，相互間參差不齊。
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來源：Scientific Reports(2018) 8:17121 | 來源： Cells 2020, 9, 80; doi:10.3390/cells9010080 | 來源： Nature Communications (https://doi.org/10.1038/s41467-020-19554-7) |
采用圖像分析軟件的旋轉功能，有可能會對條帶的圖像分析結果產生偏差。這一點，有興趣的讀者可以參考《圖像旋轉操作對Western Blot條帶定量分析影響的評估與對策》一文。因此，我們并不主張對WB原始條帶圖像濫用旋轉校正功能。
將原圖的副本保存為.Tif格式備用即可。若基于條帶的圖像灰度值進行分析統計，對于暗條亮底圖像反相轉換為亮條暗底型后保存。
二、ROI理論邊界范圍評估
打開待分析的Western Blot條帶圖像。
對于條帶外形規則的WB條帶，可首選方形選框(Rectangular Selection Tool)“圈地”，便于后續簡單地移動后套用及隨時自由地縮放ROI框選范圍。
多邊形選區工具(Polygon Selection Tool)、自由手繪工具(Freehand Selection Tool)，具有“因勢利形”的優勢，可用于“笑臉”形、“啞鈴”形等不規則條帶的圈選，便于“量身定制”去除背景像素。不足之處在于，這種ROI將無法調用Plot Profile功能模塊。
WB條帶分析選區ROI理論邊界范圍的評估，包括以下流程。
2.1 啟動Plot Profile分析模塊
點擊主界面的【Analyze】→【Plot Profile】菜單命令，調出【Plot Profile】窗口并激活實時顯示功能。
選擇圖像中條帶亮度高同時邊界清晰的一條下手。
2.2 建立ROI試驗選區
從目標條帶中選較“干凈”的一小段，建立ROI “先行試驗區”。
試驗區的高度H，根據用《ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則》的介紹，采用1行或多行像素均可，視條帶圖像具體條件而定。初始寬度W，原則是力求總攬全局，便于整體預判。
判斷條帶有效信號覆蓋范圍，要依靠Plot Profile窗口的信號強度分布曲線圖，從ROI試驗區信號主峰的左右兩翼外圍曲線走勢突然轉平或向上折返為標志，判定為信號強度和組成變化的拐點。拐點試驗區邊界的臨時紅線，但并非選區的最終有效邊界。
以像素列為單位，以左右兩側曲線的拐點為界，由兩側向中心把曲線覆蓋區域依次分為背景區、緩沖區和理論檢測信號區。左側拐點曲線變化劇烈，通常可視為信號與背景臨時分界線。右側拐點附近曲線趨勢平緩。藍色區域曲線的走勢，在后續隨著ROI擴大，通常會因背景信號成份加入而進一步變緩，最終轉變為背景區而被排除，故劃為緩沖區。
據此初步判斷，該條帶位置位于x4 - x23區間，此范圍即后續ROI的紅線。
以下是實際工作中常見的條帶信號分布曲線圖的幾種拐點標志。
實際實驗圖像中，一側曲線邊緣呈現雙重拐點標志的情況，亦不罕見。這種情況下，應以離主峰最近的拐點計算紅線。
ROI試驗性評估步驟，對于強背景干擾條帶、弱信號條帶和像素不規律分布或/斷裂型弱信號條帶ROI創建中有效邊界判定，具有重要指導意義。
三、在ROI試驗區上擴展創建正式ROI
良好的開端是成功的一半。
而創建科學合理的Western Blot條帶分析選區，對于分析數據的精準可靠所發揮的作用，恐怕要超過一半。
精確界定ROI范圍，通常需要在ROI實驗區的基礎上，經歷幾個環節的精雕細琢，選區的創建才能趨于合理。
3.1 確認選區的高度
選區的高度，即條帶長軸的長度。
保持即有ROI試驗區的左右邊界坐標不變、寬度不變，移動上、下邊框，調整選區高度，直至選區足夠覆蓋比目視下條帶上下邊界即可。
當條帶信號弱而背景強，條帶間起止界限不容易肉眼判別時，可參考兩個辦法來確定：
1）圖像旋轉90°后，在Plot Profile窗口，矩形選框同時圈定2個相鄰條帶，從兩個主峰之間曲線走勢低谷，找出交界地點；
2）根據圖像上條帶最清晰的兩個相鄰條帶各自長軸長度和條帶間隔大小，判定其余條帶的大致位置分布和長度。
不同條帶的ROI高度，視實驗和圖像條件，可能存在1-4個像素的差異。
3.2 優化選區的寬度
選區精確界定是個精細的活。
通常，隨著ROI試驗區上下選框擴張，Plot Profile顯示強度分布曲線主峰的兩翼的曲線部分會發生明顯改變：或變得更平緩或出現新的拐點。此時，應進一步收窄ROI范圍到新拐點。但接下來有2個細節，是需要妥善處置的。
3.2.1在Plot圖上精確判定條帶有效信號分布邊界
先看一幅圖，有助于對ROI創建規則有更深入清晰的概念。用柱狀圖高度代表像素列強度，Plot Profile相當于將每列像素的柱頂連接形成常見Plot曲線圖。圖中框選了21列像素，對應的水平坐標值分別標示為0-20。
根據曲線圖主峰兩翼末端外圍1-2列像素強度值曲線，評估目前選區范圍圖像背景強度水平（如圖中的虛線所示）。將強度高于背景水平線的像素列視為有效信號。
此時可初步認定，選區信號分布范圍介于3-17號像素列。
觀察發現：此時確定的選區范圍，相當于從拐點出發左右各縮進一列像素后范圍。這正是本文前面提到的，拐點只能作為選區的初始紅線而不能以曲線拐點作為邊界的道理。
3.2.2 結合圖像上條帶的結構特點優化選區
在選區創建中，Plot Profile只能算老司機的車載導航儀。由于曲線依據像素列的強度均值而呈現，但并沒有區分背景和信號組成比例的功能。完全依賴Plot圖設定ROI，輕則夸大選區分析值，重則誤導分析結論。
實際操作中，還要綜合條帶圖像邊緣部分像素列結構的完整性、圖像周圍背景分布，才能有效確認條帶選區邊界。
通常，條帶邊緣像素列的斷裂痕跡是可靠的定位參考標志物。
如圖所示，所謂的像素列斷痕，就是用綠、橙、紅色標示的像素。這些像素信號由于自身強度劇減，使具有相同水平坐標的像素群組成的像素列表現出縱向“斷裂的痕跡”。
其中靠條帶內側的綠色“斷裂帶”夾雜明顯有效信號像素，橙色斷裂帶則無肉眼可充分辨識的有效信號像素，但未見背景像素。而紅色“斷裂帶”中則可見為數不少的背景像素。
通常，判定ROI是否符合IiamgeJ軟件分析要求，以下兩條建議可以參考。
1）條帶選區兩側的邊緣，不應包含肉眼可直觀判識的背景像素。
在遇見條帶邊緣的某個弱信號像素列，到底應算作有效信號還是視為背景須從選區排除而難以取舍時，可以該列像素是否包含背景像素作為劃分標準和底限。
2）合格ROI選區的Plot Profile曲線特征是：信號主峰兩翼末段的曲線，應以一定斜率“接地”或呈向下傾斜態勢。
如末段呈現上樣或水平狀態，有悖于WB條帶信號分布一般規律，應予調整。
ROI設置完成后，點擊鼠標右鍵，在彈出菜單中點擊“Add to ROI Manager”，系統自動彈出ROI Manager面板。
為便于管理和記憶，ROI的數字名稱可用Rename命令更名。
四、ROIs方案保存和管理
4.1 ROIs保存
為便于進一步分析和資料整理，避免每次花費大量精力重建選區，全部條帶完成ROI創建后，在ROI Manager窗口確認【show all】激活和全部ROI呈現在圖像上后，點擊軟件File菜單，軟件的Overlay功能將ROIs信息疊加在圖像上。
選擇一個便于管理記憶名稱，以Tif格式保存圖像操作結果。
需要注意的是，無論是網絡版還是脫機版，ImageJ軟件默認保存路徑是windows系統下默認的下載文件夾。下次原路徑下打開圖像后，已經創建完的ROIs會自動呈現，并可進一步編輯和分析。
4.2 ROIs設置的復制轉移
創建的ROIs設置可以被復制套用到新的空白圖像中。方法是：
A.打開已創建ROIs設置并保存的圖像；
B.激活ROI創建工具中的方形選框，依次點擊激活每個ROI。此時，ROI黃色邊框轉換為帶調節按鈕的形式，執行Add to ROI Manager操作；
C.打開相同規格的新圖像后（要求兩幅圖像尺寸一致，同時條帶形狀、位置及大小一致），點擊ROI Manager中【show all】或同時勾選【labels】選項后，上一幅圖的ROIs設置將在新圖像中精確再現。
當打開多幅圖像后，只有其中一幅圖像處于激活狀態。點擊要分析的一張圖，則另一張圖將自動退出激活模式。通過簡單鼠標點擊切換，可隨時分析兩幅圖中ROIs。
D.把需要對比的兩個不同ROI分別激活，分別執行Measure→Plot profile命令，可同時顯示兩個ROI的峰形圖。
分別執行Measure，可調出共同Results窗口，計算結果按激活順序顯示在同一個窗口，便于比對分析。該功能適用于同批次實驗中不同圖像之間的比較。
參考文獻
1. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)
2. ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則
