讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-2

        《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測-下》一文提到，用ImageJ軟件對圖像定量分析流程中， 分析選區（ROI）的合理設置是基礎。但用Image J軟件為Western Blot條帶定量分析設置ROI的操作方法、操作質控和驗證的標準，Image J用戶指南并無介紹。
       他山之石，可以攻玉。我們不煩先了解一下，Bio-Rad、Alapha和UVP等專業凝膠圖像分析軟件操作指南中，有關電泳凝膠圖像和Western Blot條帶分析選區ROI設置經驗做法。

一、專業圖像分析軟件關于ROI創建的指導要求

1. 1 AlphaView Software-講究松緊適度

       Alapha公司的AlphaView Software 在用戶指南【Chapter 5:Image Analysis Tools 的Multiplex Band Analysis】指出，ROI邊框要充分圈選全部待分析對象，實現“應檢盡檢”。

       采用“一帶一景”（Local Background）“因區施策”法計算條帶背景時，將選區中強度值最低的10個像素作為采樣背景取其均值作為該條帶背景值（Background region applied using the average of the 10 lowest pixels in a band region）。這就要求創建的ROI要略大于被檢測條帶（slightly larger than the bands），確保選框內有足夠數量（不應低于10個）的條帶背景像素，同時，避免引入過多背景像素和摻入鄰近條帶像素。

       正如AlphaView指南給出的object示范那樣，ROI上、下、左、右四個方位選框內側，都應該包含不低于1個像素寬度的背景。

1. 2 Bio-Rad Quantity One-力求完整包容

       Bio-Rad公司Quantity One在指南中對分析選區ROI創建要求是，繪制的選區要囊括全部含有數據信息的檢測像素。針對背景不均勻的圖像，采用Local background背景扣除法時，選框內應包含一圈1個像素寬但結構連續、完整的圖像背景地帶。選區最外圍1圈像素強度值（intensities of the pixels in a 1-pixel border around the volume）之和除以邊框像素總數（total number of border pixels）所得均值作為該選區的背景值。

       換句話說，如緊貼ROI選框的像素背景像素缺失或誤入過多強悍的背景干擾像素，軟件依然將外圍一圈像素視作背景，據此產生背景強度將升高，必會造成檢測信號損失而拉低選區的檢測值。

1. 3 UVP LS Software-安內攘外并舉

       UVP公司的LS Software的Define Area Density Background操作，其指南在【Define Background】中指出，在針對復雜不均勻的Western Blot條帶圖像進行Area Density分析時，軟件默認每個ROI選區都會自動定義一個VIP專屬背景（separate background）。這個用于自動計算圖像背景值的選區，位于標記選區外，其寬為選區邊框外緊鄰的三個像素（three pixels wide），長為三個像素湊成的狹長環形區帶的周長（the total of the perimeter around the region marked）。

       概括起來即，ROI內全部像素為檢測目標像素，ROI選框外推三個像素的環形區域視為背景帶。 

1. 4 小結

       以上調研表明，Bio-Rad、Alapha和UVP等知名凝膠圖像分析軟件在條帶定量分析中，對分析選區ROI的設置規則有所不同。其區別的關鍵點在于，分析選區內是否需要引入圖像的背景以及對背景像素范圍的控制。

1）選區內背景分析法

       這種分析模式的代表是AlphaView Software和Bio-Rad公司的Quantity One軟件。

       所建立ROI的最外圍一圈須是背景像素，相當于采用有效像素區外延伸一圈像素，作為該條帶背景的計算依據。

       此模式產生的選區背景的特征是：選區內所有像素均被扣除相同數量的背景值。其背景去除效果，類似于Photoshop的圖像亮度整體調節功能。

       適用對象為：Western Blot實驗圖像上條帶的背景均衡、均勻，且信號峰前、后均背景本底條件一致或十分接近。

2）選區外背景分析法

       以UVP品牌LS Software軟件為代表的這種分析模式，分析選區內部全部視為有效信號像素，從選區邊框向外延伸3圈像素寬度作為條帶參考背景。

       這種模式產生的選區背景適用對象與前一種分析模式相同。

      與前一種選區設置要求的區別是，它采用ROI外部的3圈像素的均值計算背景，而前者是ROI內部最外圍1圈像素作為背景。       

       現在的問題是，ImageJ軟件在用于Western Blot條帶定量分析過程中，ROI創建應該遵循什么規則？

       要回答這個問題，首先要了解ImageJ軟件中ROI的特征。而觀察和分析ROI，最直觀有效的方法之一，就是下面要討論的Plot Profile分析模塊。

二、ImageJ軟件Plot Profile分析模塊功能特點
2.1 Plot Profile模塊工作界面 

       在ImageJ軟件中執行【Analyze】→【Plot Profile】命令，即可調出Plot Profile分析模塊，顯示直線選區（line selections）或矩形選區 (rectangular selections)的像素強度-水平距離關系二維圖形。  

       X軸代表垂直方向像素列離開選區左側邊界的水平方向距離（distance/pixels），即水平方向跨越的像素數量（horizontal distance through the selection），用像素數表示。
       Y軸代表選區內垂直方向像素列的平均像素強度值（vertically averaged pixel intensity）。本示例為Western Blot暗底白帶型效果圖，列強度值為像素灰度值。

       對于矩形選區(rectangular selections)，當選區為2個像素或像素列時顯示為斜線圖；選區像素列達到3個像素顯示為峰線曲線圖。
       用矩形選區可選定當行像素顯示單行或多行像素的峰線曲線走勢圖。在ImageJ軟件為Western Blot實驗條帶創建分析選區ROI時，這個功能可用于預判斷條帶邊界范圍。

       當選區為1個像素列時，在窗口左下角顯示的數值為該列像素的強度均值；

       當選區僅包含1個像素時，顯示的是該像素灰度值。
       點擊菜單中【Analyze】→【Measure】命令，在彈出的【Results】窗口中，顯示的是黃色選框內從像素列0到像素列16在內全部像素的統計分析結果。

2.2 Plot Profile實時顯示功能 

       點擊Plot Profile窗口底部的Live按鈕，字體可在紅色-黑色之間隨意切換。

       當Live呈現為紅色字體狀態時，當前活動圖像窗口選區的調整變化，窗口的選區像素強度值峰線曲線圖隨之發生改變。這一功能，對于創建Western Blot條帶分析選區ROI，具有特別重要的參考價值。

       此外，在后續對選區背景扣除條件設置方案的評估中，可實時預覽不同背景扣除條件的去背景效果，有利于背景扣除條件的評估優化。 

三、運用ImageJ軟件為Western Blot實驗條帶建立選區ROI的基本原理和規則 

3.1 用ImageJ軟件為Western Blot條帶建立分析選區的基本原理

       一般認為，CCD成像系統生成Western Blot圖像強度信號，包含三種成份，即CCD成像芯片本身的電子噪音，來自實驗樣品（如轉印PVDF膜、化學試劑和緩沖液的自發熒光）的光子信號和條帶發光產生的檢測光子信號。對在成像過程，CCD本底噪音電流效應、樣品背景光學能量和連同條帶釋放的光學能量都被如實記錄。CCD對感受電子信號不問出處，來者不拒，是無差別累積存儲。因此，圖像中的像素強度值是由圖像背景、檢測信號和CCD本底噪音三者相生相伴、相互疊加形成的。圖像的背景與檢測有效信號這兩股勢力之間，并非此消彼長的博弈和競爭的關系。
       而ImageJ軟件的Plot Profile分析模塊顯示的圖像信號分布-位置關系圖中，任一像素列的強度數值，同樣是背景-信號的綜合值。
       眾所周知，WB條帶的蛋白含量有其特殊分布規律：沿著條帶電泳方向，離開條帶短軸中軸線越遠，條帶含量越低直至最終消失。因此，在圖像短軸方向上，檢測信號與背景信號疊加信號強度也相應響應衰減趨勢。表現在Plot的圖像信號強度分布圖上，是信號分布曲線隨著條帶信號分布，呈現出低谷-峰值-衰減-低谷的規律性變化。
       依據圖像某個區域信號強度曲線的顯著變化，即可判定此處條帶有效檢測信號高低和有無，據此評估條帶有效信號的分布范圍。

3.2 用Plot Profile分析模塊創建WB條帶ROI的基本規則

       首先，重視利用Plot Profile模塊分析功能，以圖像信號曲線走勢，指導研判條帶有效信號分布范圍；

       其次，Measure分析的是ROI內全部有效像素的分析統計值。因此，ROI須最大程度地囊括條帶的全部有效信號像素，同時限制和盡量減少背景像素進入選區。ImageJ圖像分析軟件創建的分析選區ROI不僅不需要引入背景像素做參考，想法，還應避免框選代表圖像背景的像素。這一點，與其他專業凝膠圖像分析軟件的選區設置規則，存在根本區別 。

       再次，ROI設置合理與否判定標準之一是，背景扣除后，ROI統計值中min值應為0。min值大于0，則需適度調整選區位置和范圍，重新計算滾球半徑。

       創建ROI的具體流程，可參考《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區》。

用參考文獻

1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4

2. AlphaView Software User Guide_94-13934-00 Revision 3a (2011)

3. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)

4. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)