讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-1

3 討論部分

3.1 專業電泳凝膠圖像分析軟件指南有關圖像數據值的說法

       調查發現，部分專業電泳凝膠圖像分析軟件用戶指南中，內容設計上存在某些疏忽，的確容易引起初學者誤解和概念的混淆。
3.1.1 Bio-Rad公司的用戶指南
       伯樂Quantity One User Guide^［1］文件有眾多示例圖，均沒有注明圖片類型和來源，測試值均標示為光密度值。如：
       【5.3 Identifying and Editing Individual Bands】圖Fig. 5-7，條帶峰值顯示為Optical Density；
       【5.7 Gauss-Modeling Bands】圖Fig. 5-13，圖像背景指標值為Uncalib. Optical Density；
       【10.1 Report Window】中圖Fig. 10-2 Example of a report window的protein report，采用Peak OD、Average OD測試值。
       這些現象，使人們容易產生protein-OD值關聯的直覺。

        但實情是，Quantity One用intensity of the pixels指代電泳條帶、凝膠的背景測試值，文件【10.6 Volume Analysis Report】和【4.1.e Lane Profile】兩處皆是。
       此后發布的Image Lab Software User Guide^［2］文件，這方面就改進了。

       【Chapter 3 Image Lab Software Overview】一節明確指出：
       Main Window狀態顯示欄顯示的測試值分為intensity (Int)和optical density (OD)兩種，數字范圍為0–65535 (16比特) 或0.0–4.0 (OD)。
       可見，Image Lab Software User Guide對圖像灰度值與光密度的概念是有嚴格區分的。

      
3.1.2 美國Alpha公司發布的指南文件
       AlphaView Software User Guide^［3］中Multiplex Band Analysis】、【Lane Profile】、【Analyzing Arrays】和【Measuring Density】等多個章節中多次采用含有density一詞的表述。譬如，density of bands，density value，Measuring Density，pixel density等。望文生義容易給人誤覺，以為指代測試值用的密度（Density）正是光密度（Optical Density）的略稱。
       其實，該指南在【Contrast Adjustments】 、【Appendix B: Data Description Tables】等處明確測試值為圖像灰度值pixel gray levels。在【Histogram】 一節專門對圖像灰度gray levels做了科普性闡述。

       除density，指南還使用pixel intensity指代圖像測試值。
       這說明，Alpha公司指南中，電泳條帶分析中對于圖像灰度值和光密度值概念使用是很明確的。

3.1.3 UVP公司《LS Software User Guide》
UVP的《LS Software User Guide》 ^［4］在“通則”部分用intensity指代測試值。
       gray levels僅出現在【Image Acquisition】一節，而density則見諸于【Area Density Analysis】和【Estimate Region Volume】兩個模塊有關篇幅。
       但須指出，該指南在【Perform Area Density Analysis】中【Area Density Results Definitions: "Density List" Tab】中指出，ROI測試值Total Density/Intensity分兩種，即灰度值（Grey-Levels，GL) 或光密度值（Optical Density，OD)。具體測試值的選擇須依Intensity Calibration curve校準類型而定。
       可喜的是，該指南還對Optical Density、Grey Levels兩種實驗圖像測試值的適用對象做了明確規定。實質內容與ImageJ用戶指南^［5］一致。

       歸納起來，專業凝膠圖像分析廠家的技術指南文件中，圖像強度分析數值分為圖像灰度值（GL) 和光密度值（OD)兩種，二者可統一用density（密度）或Intensity（強度）指代。

       density并非專指Optical Density（光密度值，OD），要視具體分析的圖像類型而定。蛋白考馬斯亮藍染色凝膠、銀染凝膠圖像和Western Blot實驗中ECL法檢測原始圖像，分析所用的圖像強度值涵義是不一樣的。因此，不可離開具體圖像類型，把光密度（Optical Density)與密度（density）混為一談，更不能把所有電泳凝膠有關的圖像分析，不加區分二簡單地冠以圖像光密度或者圖像灰度值。

3.2 Western Blot條帶蛋白定量分析中圖像強度值概念問題

       關于OD值和GL值的概念和運用，可參考《光密度值和灰度值如何在Western Blot條帶定量和凝膠圖像分析中應用?》一文。簡而言之，就Western Blot實驗圖像分析應用而言，可以總結為以下3個要點。
       1）光密度Optical Density或密度density：可用于指代經典放射性自顯影成像技術獲得的膠片、膠片經透射型掃描儀掃描獲得的亮底暗帶型圖像的強度值；
       2）目前普遍使用的ECL發光檢測功能Western Blot印跡成像分析系統，其采集的亮帶暗背景原始圖像經反相處理為亮底暗條帶型仿底片圖像強度值，用光密度Optical Density指代是對的；
       3）放射性自顯影曝光后沖洗所得的暗底白條帶照片圖像，還是ECL印跡成像系統采集的暗底白條帶原始圖像，應用“灰度（Grey-Levels)”或“密度density”值指代圖像強度值。
       

3.3 圖像灰度值應用于Western Blot條帶定量分析的可行性

       本次實測的圖像源自伯樂ChemiDoc MP Western熒光化學發光凝膠成像系統采集，但參考業界發文習慣做法，原圖已處理為亮底暗條帶的仿底片圖像。基于3.2的討論，須將發表圖像再次反相處理，以還原為ChemiDoc MP系統采集的原圖效果，方可用于圖像灰度值分析。

       依托條帶創建ROI取得像素灰度值散點曲線圖和指數型趨勢線，顯示高度相關（R²＞0.998），并且該趨勢線與電泳時蛋白初始載量歸一化數據的趨勢線（R²＞0.999）軌跡高度一致。趨勢線指數方程的各指數常數高度接近，表明從圖像逆向分析，通過分析圖像灰度值數據，非常成功地再現了蛋白電泳初始載量數量對比關系。

       提示：在Western Blot實驗中，直接采用ECL化學發光成像平臺采集的暗底白帶原圖，基于圖像灰度值指標進行分析，合理且可行。

      結合其他多次類似圖像的實測結果（未總結發布），足以驗證ImageJ等專業圖像分析軟件的指南對Western Blot ECL化學發光圖像分析數值類型選擇指導意見的正確性。 

3.4 總結

       Western Blot實驗由于早期使用的是放射性自顯影成像檢測技術，圖像曝光后的底片圖像為白底暗帶形式。而目前，采用CCD-化學發光成像檢測技術已大行其道。但WB實驗結果發表時，為照顧業已約定成俗、根深蒂固的“審黑”習慣，依然采用仿自顯影底片圖像。

       假作真時真亦假。把未經反相處理的原圖本色發表，反而顯得違和感太強，變成了一種錯誤的“正確”。

       在正式發文中，在描述圖像強度值時，如有必要，采用的是圖像灰度還是光密度值進行的分析，措辭須份外留神。不可正對仿底片型圖像大談圖像灰度值分析，以致鑄成高水平論文中“圖片使用不當”的“院士級”錯誤！

      基于圖像灰度值分析反向再現Western Blot條帶蛋白初始載量精確數量關系的實測結果說明，基于化學發光CCD成像分析系統采集的原圖灰度值數據直接進行蛋白條帶定量分析的方法，技術原理上合理，操作上靠譜，結果上完全可以達到分析目的。

     實測中屢戰屢被的經歷告訴我們，Western Blot實驗圖像均存在復雜、不均勻、干擾背景偏高的現實條件下，用ImageJ軟件對圖像定量分析，從ROI創建到選區背景扣除的全過程是一個極具挑戰的過程。

       感悟就是：ROI合理設置是基礎，背景扣除設置條件的有效是關鍵。

       關于如何在WB條帶定量中設置好分析選區的具體操作技術問題，可參考阿拉斯科技(www.aizailushang.cn)《百家論壇》欄目發表的《ImageJ創建Western Blot條帶定量分析選區的基本規則》和《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區》等文章。

參考文獻

1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4

2. Bio-Rad Image Lab Software User Guide Version 6.1

3. AlphaView Software User Guide_94-13934-00 Revision 3a (2011)

4. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)

5. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)

6. Bulletin 6305：Clarity and Clarity Max Western ECL Substrates, Ver. D