讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-9

       曾有Photoshop培訓師課堂提過，將圖像以90°或90°的整數倍數進行圖像的旋轉、水平翻轉、垂直翻轉后，對圖像無損。但若以其他角度旋轉，則會損害圖像品質。
       無論Photoshop還是ImageJ等專業圖像軟件，自帶Image Enhancement工具，可實施圖像的Adjustment, Rotate（旋轉）, Flip(對稱翻轉)，Resize（大小縮放）等多種調整操作。軟件是通過不同圖像插值算法（可簡單理解為對原圖像中所有像素通過某種算法模型計算，按計算結果為新像素賦值的方法，對圖像像素重新布局的方法），對全部像素進行了 “異地搬遷重建”,會不同程度損害圖像質量，如圖像邊緣銳度和圖像像素強度。
       Western Blot實驗中，會經常出現條帶排列位置傾斜的現象。在WB條帶蛋白定量分析時，對圖像旋轉修正，是否會影響條帶的分析值？條帶圖像傾斜有何建議和防范對策？   

一、實測ImageJ對Western Blot圖像旋轉對條帶的影響

1.1 圖像來源：詳見《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測》相關內容。
1.2 圖像準備：將Clarity Max.tif用ImageJ軟件中【Image】→【Transform】→【Rotate】菜單命令，選擇雙立方插值（bicubic）設置，按+1.6°、-3.6°和-10°旋轉圖片后，分別保存為Clarity Max-Rotate 16.tif，Clarity Max-Rotate 36，Clarity Max-Rotate 100.tif備用。
1.3 選取各組中的條帶3，分別構建3個分析選區。
       以條帶3中軸線和中心為參照，如圖1-1所示，采集圖像不同部位代表高、中、低信號強度的像素，按《ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則》方法統計這些單像素選區的圖像灰度值。

表1  旋轉前后條帶的像素點圖像灰度值測試結果

       表1數據顯示：
      1）同一個條帶上相同位置像素，旋轉到新坐標點重構后，各像素強度值的還原程度不一。1.6°旋轉組與原圖組的測試數值接近或相同，而3.6°組和10°組數值存在較大誤差，尤以10°組誤差為甚；
      2）旋轉重構誤差效應在圖像中強、中等、弱信號像素群都存在。
      調用【Plot Profile】分析模塊，對3個旋轉組進行Plot分析，結果見Fig 1-2。
 

       圖1-2顯示，隨著圖像旋轉角度從1.6°、3.6°加大10°，選區圖像信號強度分布形態發生改變。
      1）峰值從原圖的142.6變為142.7，139.2和130，變化幅度隨著旋轉角度加大而加大。同時，峰頂由偏態過渡至對稱狀態，最后出現鈍化呈現偏態有調整跡象；
      2）峰的一側曲線末段走勢轉平緩，圖像強度值升高；
      3）選區范圍增大，選區寬度從最初13個像素擴充為14個像素。
      4）旋轉后，條帶主體部分的面積變化不顯著，但選區左右兩側像亮度較低區域形狀、面積都有明顯不同。同時，選區右下角的強背景干擾區與選框相對位置發生變化。
      在條帶3的Plot Profile分析結果觀察到的現象，還重復發生在同組的其他條帶上（見Fig.1-3和Fig. 1-4）。

      各組間條帶5選區范圍一致，但峰值、峰頂行轉有所區別，同樣可見一側曲線末段斜率增大現象。

      各組間條帶9選區分布范圍、峰值和峰頂均有明顯變化，一側曲線邊緣部分斜率增大。
      Plot Profile分析表明，將Western Blot條帶圖像以小小角度旋轉，等于條帶經歷了一場變革：
      1）旋轉重構像素值的誤差，不僅改變了條帶主體的像素強度信號，也改變了條帶周圍圖像背景像素群的信號分布。條帶還是那個條帶，但選區分析的目標像素群則已物是人非；
      2）構成條帶的主體部分，作為選區內圖像強度值最高的像素群，原來高度集中分布在有限的幾個像素列。旋轉后的條帶從豎直或接近豎直狀態逐漸傾斜，使高強度信號像素由中軸線向條帶兩側水平分散，使條帶峰值下降，峰頂外形（峰值、峰度、偏度）轉變。同時，還造成條帶邊緣部分像素列信號強度增強，以及弱信號條帶信號分布范圍的擴張；
      3）條帶旋轉改變了圖像強背景信號團塊與條帶邊緣部分的接觸狀態，部分弱信號像素得以在Plot Profile圖中被“激活”而“歸隊入列”；同時，條帶邊緣弱信號像素因陷入圖像背景包圍而被排除出選框。不同旋轉狀態，使選區內有效檢測信號像素群的“純潔度”有了差異。

二、圖像旋轉對Western Blot條帶選區統計分析值的影響
2.1 ROI建立
      參考《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區》的方法，分別為Clarity Max組、Clarity Max-Rotate 16組和Clarity Max-Rotate 36三組圖像全部條帶創建ROI。按《Western Blot條帶分析中如何計算ImageJ的滾球半徑？》介紹方法，核實ROI選區背景扣除滾球半徑，采用《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測-上》相同背景扣除設置選項條件和統計值處理流程。觀察旋轉前后各組條帶選區分析值的變化。

2.2選區初始值統計結果

表2  組間選區圖像初始值表

      表1數據顯示，原圖、順時針旋轉1.6°和逆時針旋轉3.6°三個組各選區Area、Mean、Min、Max、IntDen均出現不同程度的變化。其中：
      Max值變化，提示條帶信號最強部分像素的強度值旋轉后沒有完全復原；
      Mean值變化，提示條帶整體亮度發生改變；
      Area值改變，說明旋轉后條帶信號強度分布范圍出現變化。
      將各組的測試值與同組內測試值相對穩定的條帶4測試值的比值，繪制成散點圖見Fig.2-1。

      圖2-1顯示，與各組圖像初始IntDen比值的差異比，校正背景后組間差異被明顯放大。整體上看，原圖組與旋轉1.6°組的曲線軌跡較一致；而3.6°旋轉組的曲線走勢差別明顯，這或許與組中條帶3、7、8、9測試值的劇變有關。

      圖2-2顯示，原圖組與蛋白初始載量組分析數據比值的指數趨勢線高度吻合；1.6°旋轉組趨勢線指數方程常數與蛋白初始載量組接近；但3.6°旋轉組曲線則有明顯偏離。
      實測提示，條帶旋轉使目標條帶ROI統計像素群的強度類型，像素數量都可能發生改變，結果導致選區IntDen值產生誤差。雖然Western Blot條帶圖像旋轉角度大小與選區分析值誤差程度的關聯還有待進一步觀察。但圖像小角度旋轉對Western Blot條帶選區定量分析產生影響是可以肯定的。因此，在Western Blot實驗需要準確評估組間量效關系時，對原始圖像旋轉后再分析的做法應盡量避免。
      實驗中應力爭使條帶的圖像規整，無疑有利于提高分析的精準度。

三、在Western Blot實驗中如何解決條帶圖像傾斜對分析結果的干擾
      Western Blot實驗由于電泳、電轉實驗環境條件、實驗規程和實驗者操作經驗技術等軟硬件差別，電轉獲取的圖像中的條帶排列的不規整現象極為常見。
      追根溯源，在WB實驗流程中，實驗室創造必要硬件環境，無疑是確保轉印膜上條帶圖像水平規整行之有效的手段。
      就目前資源而言，有兩種硬件保障措施是可以考慮的。

2.1 用Gel Alignment Template幫助凝膠和轉印膜擺放位置規整
      Gel Alignment Templates，凝膠樣品成像定位板或稱為樣品中心對準模板，用來快速、精確地定位ChemiDoc MP和ChemiDoc Imaging Systems成像系統的樣品托盤上的凝膠和轉印膜樣品。
      外形如同相框，框的外側與樣品臺成像區大小匹配，而框內尺寸與實驗室常用的凝膠尺寸一致。模板安裝到樣品臺后，只需把待成像樣品擺放到框內，框-樣品四周實現嚴絲合縫，避免出現傾斜現象，從而確保樣品擺放方方正正，所有條帶的圖像保持同一水平位置。
      模板分為mini和midi兩種規格，凝膠或轉印膜通用，與Bio-Rad開發的樣品托盤完美匹配。

2.2 配置帶樣品自動調節功能的Western成像系統
      賽默飛英捷品牌的蛋白免疫印跡成像系統樣品臺沒有伯樂成像系統那樣的樣品定位板，但卻配置可自動調節的旋轉樣品臺。
      Invitrogen iBright CL750、iBright CL15 Western Blot凝膠成像系統及iBright FL1500 Western Blot凝膠多功能成像系統標配的自動機械式旋旋轉載物臺，能自動識別樣品擺放位置，并能自動將樣本順時針或逆時針方向旋轉10°，提前修正樣本位置。
      這個功能同樣可使圖像中條帶的位置保持水平一致。這樣有效避免在成像采集完成后軟件實施數字旋轉操作，從而最大程度保持圖像數據的原貌完整性。

參考文獻
    ［1］在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測-上
    ［2］ImageJ創建Western Blot條帶分析選區的基本規則
    ［3］如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區