應用驅動型qPCR儀選型攻略-9

一、TaqMan Array Card的工作特點

       TaqMan探針低密度陣列(TaqMan low-density array，TLDA)，即TaqMan探針陣列卡(TaqMan Array Card，TAC)，是依托5’-端核酸酶水解原理TaqMan探針和實時定量PCR儀這一技術平臺、采用特殊生產工藝和結構制成的384孔檢測板（為方便表述，下文統一使用TAC簡稱）。

       TAC于2003年9月隨ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System一同推出，主要用于高通量基因表達的定量分析。最早被命名為TaqMan Array Micro Fluidic Card（微流體芯片）。目前的賽默飛官方文件和國外刊文中，已很少使用Micro Fluidic Card的名稱。檢索2006年1月-2022年2月發表的TAC應用論文發現， PubMed庫中“PCR[Text Word] AND TaqMan low-density array[Text Word]”可查到1292條記錄，“PCR[Text Word] AND TaqMan array card[Text Word]”為453條記錄。“TaqMan Array Micro Fluidic Card[Text Word]”則僅1篇文章(因“方法”的同一段落同時用了TaqMan Low Density Array card 、TaqMan Array Micro Fluidic Card兩種表述)，而“TaqMan Array Microfluidic Card[Text Word]”則查無記錄。

       其實，TAC與微流控芯片（Integrated fluid circuit），從結構設計到工作液體控制原理都有區別。一般意義上的微流控芯片多具有復雜流路結構，測試所需液體需由微量蠕動泵和微量控制閥控制和輸送到反應微陣列單元。而TAC的液體流動和分配則是通過人工簡單離心操作，借助于離心力作用來實現每個樣品通道所轄48個反應孔的液體均勻灌注的。因此，我們建議發表論文中的關鍵詞以TaqMan low-density array或TaqMan Array Card為宜。

       每張TAC有8個獨立液流通道，每個通道連通48個容積1-1.5μL的微量反應孔，共384個孔。所有反應孔兩兩對稱排列于主液流通道兩側。每個孔內含有為目標核酸和質控基因定制的高品質且標準化生成的正向、反向引物（濃度約900nM）、Taqman探針（200-250nM）凍干后沉積物。

       吸取100μL預先與TaqMan通用預混液混勻的DNA或cDNA樣品，經TAC每個檢測通道加樣口注入液槽中，經簡單密封、離心后，裝入QuantStudio 7 Pro或QuantStudio 7 Flex、ViiA 7或7900HT Fast實時熒光定量PCR儀，即可像常規qPCR反應一樣完成擴增反應與分析。

       與常規384孔PCR板反應體系的構建須使用移液工作站或多通道移液器等額外設備協助的操作不同的是，TAC上樣只需一支200μL的單道手動移液器、一臺離心機即可完成上樣方式，實驗準備步驟簡單，不同反應孔分注體積誤差小，實驗結果一致性和重復性好。

       每張TAC可以同時運行384個實時熒光定量PCR反應，實現12-384個目標核酸同步檢測分析，實現了常規單重和多重實時熒光定量PCR反應難以企及的實驗通量和效率。

二、TaqMan Array Card在生物醫學實驗研究中應用

       TAC擁有384個PCR反應通量，一次運行可檢測數十個甚至以百計靶標。對臨床不明原因感染性疾病病原體的快速篩查具有重要價值。美國CDC在2011年就開發出集成細菌、病毒共21種呼吸道常見病原體靶點檢測TAC，用于社區獲得性肺炎住院患者中肺炎支原體、病毒感染的鑒別。美國弗吉尼亞大學則開發了針對19種腸道病原體基因的TAC檢測卡，依托全球腸道多中心研究 (GEMS)計劃支持，在巴西、東南亞、南亞和非洲等低收入國家與地區，大規模用于小兒腹瀉、腸道炎癥的病原體的檢測。此外，TAC還被大量應用于土壤傳播蠕蟲、血吸蟲病、隱孢子蟲、蛔蟲感染的流行病調查項目等。 

       TAC的高通量、多靶點同步檢測特性，賦予它在疾病遺傳分析、基因表達和轉錄水平調控機制研究、疾病診斷/治療/預后/治療耐藥性的生物標志物、生理病理活動的信號通路分析、microRNAs (miRNA）表達水平、細胞因子表達、藥效毒理學機制分析、干細胞分化等諸多領域巨大應用潛力，而取得的成果可謂異彩紛呈。 

表1 2016-2021年知名高分期刊刊發的部分TAC實驗應用文獻

        DICER1是一種編碼RNase III的基因，其突變導致miRNA功能失調極易誘發多發結節性甲狀腺腫（MNG）、胸膜肺母細胞瘤（PPB）、卵巢性索間質腫瘤（SLCT）等多種腫瘤。用TAC和7900HT Fast 實時熒光定量分析系統，對攜帶突變型（共5個突變位點）和野生型DICER1基因的MNG、SLCT-MNG患者家族成員的外周血液淋巴細胞、MNG和SLCT組織中DICER1的miRNA進行了檢測。結果表明：DICER1突變易導致家族男性罹患MNG，而女性成員對MNG、SLCT有易感性。 

       孕激素X受體(Pregnane X receptor, PXR)為肝內異種生物核受體，協調生物轉化酶及藥物轉運蛋白功能，參與藥物代謝和肝臟解毒過程。利福平、苯巴比妥等多種化合物均可作為激動配體與PXR結合，進而觸發肝細胞CYP3A4和CYP2C9藥物代謝酶基因、UGT1A1酶、ABCB1轉運蛋白等多種基因的轉錄。人類編碼PXR受體基因NR1I2的近端啟動子內存在雌激素受體、糖皮質激素受體α等結合位點。采用TaqMan Array Human MicroRNA Card，對肝細胞的754個miRNA篩選分析后發現，利福平治療后miR-18a-5p表達上調，但miR-18a-5p上調會抑制NR1I2表達和CYP3A4基因誘導。而糖皮質激素不僅通過啟動子區域上調NR1I2表達，還與3′-UTR結合域上調NR1I2表達和下調miR-18a-5p的表達。由此揭示了肝細胞中糖皮質激素對NR1I2表達調控的路徑機制。 

       血清素(serotonin) 即5-羥色胺(5-HT)，參與調節攝食、運動、記憶、疼痛及精神情緒等生理病理過程。腦干中縫背核（dorsal raphe）聚集了高密度血清素能神經元（serotonin neuron）。用定制TAC，對切除卵巢猴子單獨用雌二醇或雌二醇+黃體酮治療前后動物腦組織中，25個與DNA修復和神經退行性疾病（NDDs）相關基因表達的變化。這些基因包括：DNA修復相關基因（NSB1、NTHL1、LIG4、PCNA、POLG、SHFM1、GADD45A、RAD23A、APEX1、GTF2H5、PARP2、XRCC1、SHRPH）；伴侶蛋白-熱休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60和HSP27）；泛素酶（ubiquinases）基因（UBEA5、UBE2D3、UBE3A）；轉運馬達蛋白（transport motors）基因（KIF5B、DNCLC1、DCTN4、MAPT）和4個疾病特異性基因（SCNA、ADAM10、APP和PSEN1）。結果表明：卵巢類固醇激素對血清素神經元生存能力有益。雌二醇或雌二醇+黃體酮治療增加與DNA修復、蛋白質折疊、蛋白質降解、軸突運輸和2個正常基因的表達相關的基因表達（這些基因在神經退行性疾病中處于病理狀態）。表明這些基因對5-HT神經元表達和調控可能介導了NDDs潛在疾病過程。 

       缺氧誘導因子-1(HIF-1α)是細胞缺氧反應的主調節因子，特異性誘導microRNA-210(miR-210)表達上調，并在介導肺血管組織中的缺氧作用方面發揮重要作用。但miR-210和線粒體間的作用機制未知。將人肺動脈內皮細胞(human pulmonary arterial endothelial cell, HPAEC) 暴露于0.2%-12% O2條件24小時作為缺氧細胞模型，采用TAC對365種人類miRNA的表達水平進行了檢測。結果顯示：在HPAECs中，只有miR-210、miR-21、miR-26b、miR-146a、miR-146b、miR-150和miR-328經缺氧誘導表達上調超過1.5倍，但只有miR-210的上調超過增加25倍并呈現氧依賴式上調。小鼠PAECs缺氧暴露后miR-210表達上調了100倍。Western Blot結果顯示，0.2% O2暴露HPAECs 細胞的miR-210水平顯著上調的同時，ISCU1/2蛋白水平出現顯著下調，并持續時間長達缺氧暴露60小時。提示了miR-210直接抑制ISCU1/2表達的內在關聯，與生物信息學算法預測的鐵硫簇組裝蛋白ISCU1/2是miR-210缺氧細胞反應直接靶標的結論一致。說明缺氧時，miR-210通過在下調ISCU1/2的表達，降低調節線粒體功能的鐵硫酶、線粒體復合體I和烏頭酸酶的比活性。據此確定miR-210和ISCU1/2在缺氧應激期間調節線粒體呼吸和代謝的功能和調控機制。 

       資料顯示，TAC在信號通路介導病理變化，藥效毒理評價、腫瘤耐藥機制、干細胞分化調控、細胞因子mRNA表達譜分析，病理標志物篩查和預后評價，基因敲除動物模型驗證、病毒感染與細胞免疫機制等方面應用后，所取得的成果不同凡響。

（待續）