應用驅動型qPCR儀選型攻略-9 

三、如何設計TaqMan Array Card的布局方案 

       TaqMan 陣列卡分為庫存TAC（Inventoried TaqMan Array Card）和定制型TAC（Custom TaqMan Array Card）兩類。 

       庫存TAC針對特定應用在卡上已包被有12-381個測定靶標的TaqMan探針和引物組，無需用戶設計靶標排布，可以直接使用獲得高度可重復的結果。庫存TAC有胃腸道感染病原體檢測TAC、呼吸道感染病原體檢測TAC、基因表達研究TAC、miRNA研究TAC等。 

       定制型TAC，顧名思義，實驗者須根據實驗要求確定檢測靶標種類、數量、單個靶標的技術重復數和陽性對照靶標設置，確定TAC上靶標陣列分布圖。TAC樣品技術重復有重復1次(singlet/no replicates)、2次(duplicates)、3次 (triplicates)和4次(quadruplicates)可選。同一靶標技術重復孔內的引物-探針組成分完全一致。 

       我們先來了解一下ABI庫存的標準化TAC陣列排布設置原理。 

1）Format 16、Format 32和Format 64三款TAC，每個樣品的每種靶標為3次技術重復。

       Format 16 TAC示意圖中，左右兩列藍色數字分別8個上樣通道。16代表該款TAC可檢測靶標的種數共16種。

       由于檢測數據質控和數據分析歸一化要求，每張卡必須至少預留一個強制性地內參對照靶標（Mandatory Manufacturing Control），這樣Format 16實際可測靶標種數為15個（Target Assays）。Format 16卡上每個靶標3個復孔，16×3=48孔，所需反應孔數剛好占滿一個通道48孔。整張卡可測試8個不同樣品。

2）Format 32 TAC，用于測試1個對照靶標+31個測試靶標，每種靶標3次技術重復，所需反應孔數為32×3=96個，一個樣品需占用2個檢測通道（即2×48孔），每張卡只能測試4個樣品。

3）Format 64卡，用于測試1個對照靶標+63個測試靶標，每種靶標設3個復孔，所需反應孔總數為64×4=192個，一個樣品占用4個檢測通道（4×48孔，即圖中Port 1-4），每張卡只能測2個樣品，樣品通量為Format 32卡的一半。

       要提高檢測效率并降低成本，最直接辦法是把技術重復數量降低。

       如Format 24，每個樣品可測試靶標種數達到23種，每種靶標2個技術重復，每張TAC可測試8個樣品。4342249貨號一個包裝可滿足80個動物測試。如需篩選的靶標種數多達數十甚至上百種，為便于后期數據分析，采用Format 48、Format 96a、Format 384 卡，一個靶點一個孔，或用2-3塊板來完成技術重復，無疑十分便利。

       基于以上TAC陣列排布規律和特點，我們來看2個兩個實例。一個Human Inflammation Array (P/N 4378707) 庫存TAC，一個定制TAC。 

        Human Inflammation Array卡上共96種靶標（其中18S為對照），每個樣品占用2個上樣通道，相當于Format 96a的布局（每靶標4個技術重復）。

        TaqMan Array Card for 19 Enteropathogens即本文提到的美國弗吉尼亞大學開發的腸道病原體檢測TAC，是學術界TAC網紅。 

       該TAC可測試靶標種數共24種，理論上可以實現每個靶點2個技術重復，相當于Format 24。但實際上，它可檢測19種常見腸道病原體的23種靶標，其中15種病原體為單靶點檢測，另4種病原體為雙靶點檢測。 

       它的對照設置有特點：質控對照18S、臨床樣本陽性對照16S均為singlet；采用了Combined positive controls對照，是針對病毒、細菌靶點分別設置了DNA、RNA陽性對照。 

       技術重復設置上與標準格式有區別：病原體中Norovirus GII、C. difficile、Trichuris、Ascaris、STEC stx1和STEC stx2用的是singlet，其余病原體靶點統一為2個技術重復（并非常規qPCR中同一個樣品三個復孔法）。 

       再如嚙齒動物TaqMan Array MicroRNA A+B Card，每張TAC包含384個TaqMan MicroRNA分析，能在5小時內完成的641個microRNA測定。每個陣列包括三個物種內源性對照及一個與嚙齒動物無關的TaqMan MicroRNA靶點作為陰性對照。 

       上述兩個TAC案例提示我們：不同應用類型、不同樣品，對照靶標設置要求不完全一致。技術重復的多少、對照的設置因實驗目的和樣品異，是實驗者需要斟酌的，事關數據可靠性和TAC靶位陣列整體布局安排。 

（待續）