應用驅動型qPCR儀選型攻略-8 

       普通PCR實驗是每個反應孔中用一組特異性引物對一種靶基因片段的擴增，為單靶標或單重PCR反應（singleplex PCR/uniplex PCR/Monoplex PCR）。多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction/Multiplex PCR，mPCR）是指每個 PCR 反應孔中混合使用兩組或多組不同引物，在單一PCR反應中同時對多個DNA模板（Multiple Template PCR Reaction）或同一長DNA序列模板的不同區域（Single Template PCR Reaction）擴增的PCR反應。1988年，美國分子遺傳學家首創多重PCR方法，應用于產前、產后的杜氏肌肉營養不良癥（DMD）篩查診斷，在一個反應孔中用6組引物對抗肌萎縮蛋白基因的6個易缺失外顯子片段進行擴增。 

       將多重PCR技術作為內核，與凝膠電泳或毛細管電泳分析結合，構成完整多重PCR分析（Multiplex PCR Assay）流程，可用于感染性疾病的篩查與鑒別診斷、遺傳疾病診斷、細菌耐藥基因檢測、物種鑒定分型、基因克隆篩選、基因突變與缺失檢測、基因分型、基因修復和基因轉錄調控機制等研究。 

       把多重PCR反應作為基礎步驟，整合進NGS測序、染色體免疫共沉淀多重PCR分析（ChIP-mPCR）、多重連接探針擴增技術(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、滾環DNA擴增技術( rolling circle DNA amplification, RCA) 、SNP panel identification assay (SPIA)，多重串聯PCR（Multiplex Tandem PCR/MT-PCR)、多重PCR /液相色譜聯用分析法(multiplex PCR/liquid chromatography assay，MP/LC)等檢測流程，早已在基因文庫制備、多位點STR、SNP基因突變分析等研究中得到應用。 

       而多重PCR與實時熒光定量PCR相結合，使多重實時熒光PCR分析技術（multiplex real-time PCR assay）破繭而出。

一、多重實時熒光PCR與多重PCR概念不同

       PubMed檢索數據顯示，2016.01-2021-11期間，標題中含multiplex PCR的實驗文章共311篇，包括Nat Protocol（IF13.491，1篇）、Acta Pharm Sin B（IF11.413，1篇）、Crit Care（IF9.094，3篇）、Clin Microbiol Infect（IF19.074，2篇）、EBioMedicine（IF8.143，1篇）、Microbiol Spectr（IF7.172，2篇）。僅4篇文章標題用multiplex PCR但實際用的是實時熒光定量PCR方法（Biofire FilmArray Multiplex PCR、Anyplex II RV16、Multicolor melting curve analysis和Color-coded molecular beacons）法。

       以multiplex PCR[Body - Key Terms] AND "Nucleic Acids Res"[Journal]檢索獲得多重PCR實驗文章共61篇。其中6篇用的是多重實時熒光定量PCR分析法，在“材料和方法”中標明為quantitative reverse transcriptase multiplex PCR、quantitative multiplex PCR、Real-time multiplex assays、Multiplex quantitative PCR、Quantitative real-time multiplex fluorogenic PCR及multiplex real-time PCR。僅1篇文中使用“For multiplex PCR 200 nM of each primer (HT17, NR24 and BAT26) was added”表述，而附表1: “List of primers used”顯示，實驗是FAM熒光標記引物加溶解曲線分析的實時熒光PCR方法。

       這表明，超過98%的研究人員對multiplex PCR和multiplex real-time PCR在概念上是有嚴格區別的。多重實時熒光定量PCR分析法用的是quantitative multiplex PCR、multiplex real-time PCR assay類似表述，而非常規多重PCR的multiplex PCR assay或mPCR。 

二、多重實時熒光定量PCR分析的應用優勢

       在多重PCR中，通過在反應中包含一對以上的引物，可以擴增出多個目標序列。多重PCR有潛力在實驗室內節省大量的時間和精力，而不影響檢測效用。多重實時熒光PCR分析融合了多重PCR和實時熒光定量PCR兩種技術方法的天然優勢發展起來的，具有快速高效、特異性強、靈敏度高的特點。 

1. 內部參照（Internal Control，IC）優勢

       常規單重實時熒光定量PCR實驗中設有單獨的內參反應孔，一是檢驗擴增條件的可行性（評估PCR擴增條件和實驗設置有效性、擴增效率、PCR反應抑制程度和PCR反應假陰性鑒別等），二是用于對各樣品檢測數據的歸一化（消除不同反應孔初始樣本量、樣品準備過程差異對結果的影響）。

        在多重實時熒光PCR分析中，多個模板是在同一個反應孔中、在相同條件下平行擴增，每個擴增子為其他擴增子提供了一個內部對照，便于鑒別潛在的PCR反應失敗引起的假陰性問題。

        在基因缺失的多重PCR檢測中，多個外顯子被擴增。除非被掃描的整個區域缺失，否則只要有部分片段的得以成功擴增，就足以表明擴增反應沒有問題。所檢測到的DNA片段缺失是真實的遺傳性缺失而非檢測技術的局限、錯誤等導致的假缺失。  

2. 高效率低耗費優勢

       用相同樣品、相同反應體積時，單一模板的多重實時熒光PCR反應，只需提取一次核酸。一個反應孔相當于完成了常規單重PCR數孔的檢測任務，樣品與試劑消耗、PCR體系構建準備工作量與時間投入都顯著減少。

       當臨床樣本難以收集或所獲的樣品體積受限（如中樞神經系統疾病采集的脊髓液、孕婦羊水標本等），或當多個可導致同一臨床表現的不同病原體感染疾病的篩查，單次采樣檢測多個致病靶點，可在短短2-3小時內實現疾病快速、精準診斷，有利于及時啟動針對性治療和傳染性疾病的防控措施。

       雙重實時熒光定量PCR反應是在同一反應孔同時擴增靶序列和內參，較常規兩種序列分開在兩個單獨孔中進行單重反應，反應板樣品通量提高2倍。同時，每個反應孔都減少一半樣本和試劑用量。若將兩個檢測靶標與一個內參組合進行三重實時熒光定量反應，則樣本用量和試劑用量將進一步降低。 

3. 反應模板質量的可靠指示能力（Indication of Template Quality）

       PCR反應的理論效率為100%，表示在指數擴增階段每次熱循環后的擴增產物數量翻倍。但擴增片段的長度、GC含量、反應中各組分的濃度以及聚合酶品質等諸多因素影響，導致實際PCR反應效率低于 90%。

       因生物樣品本身就可能含有抑制逆轉錄和PCR反應的多種成分，如動物肌肉中的肌紅蛋白、尿素，植物組織中的多糖多酚等。多種常用的核酸提取純化試劑，如苯酚、氯仿、SDS等能抑制Taq酶的活性。抑制劑殘留過多的低純度反應模板，會抑制PCR反應，使得擴增效率超過 110%。通常，抑制劑在高濃度模板中的濃度高，PCR抑制作用強；模板稀釋后抑制劑濃度下降，抑制作用隨之減弱。

       因此，當擴增效率＞110%或＜90%，說明PCR效率存在異常。

       此外，反應模板如有降解，則引物無法有效退火步驟穩定與目標區域結合，也會造成擴增效率下降。因此，高品質的反應模板是確保實時熒光定量PCR反應效率、檢測靈敏度、定量準確性和定量檢測線性范圍的基本要求。

       多重PCR反應比單重PCR反應能更有效地反映模板質量。

       在多重反應中，模板發生降解后，會出現長片段的擴增信號比較短目標序列信號弱的征象。此外，PCR抑制劑導致的擴增效率降低通過高豐度對照序列擴增損失和參考標準曲線實驗中豐度極低靶序列的擴增效果予以判別。 

4. 模板定量的精度優勢

       多重實時熒光定量PCR實驗須將檢測目標序列擴增數據用內參對照測試值做歸一化處理和分析。

       PCR反應體系準備過程中移液精度波動、儀器熱循環模塊反應孔間溫度均一性和模塊溫控精度誤差等客觀因素制約，即便同一個樣品分散在多個不同反應孔中進行單重PCR擴增時，triplicate或quadruplicate技術重復的孔間檢測數據往往也不一致。同理，將待測靶點與內參分開各自獨立擴增取得的初始數據歸一化結果，與二者合并執行多重PCR反應的標準化數據，存在差異是毋庸置疑。而且數據差異程度會因操作誤差和儀器溫控性能區別而異。

       目標序列和內參合并執行多重實時熒光定量PCR反應的優勢顯而易見。由于同一反應孔中的靶點和內參數據源于一次加樣，PCR體系構建中加樣操作誤差對靶標和內參的影響均衡化。用同一反應孔的內參對靶點標準化所得數據，比利用單重PCR反應獲得的結果，誤差小，精度理應更高。 

對于高精度定量實驗，如拷貝數變異（copy number variation ,CNV）分析實驗，模板拷貝數具有2倍差異時，7300、7500實時熒光定量PCR儀檢測精度就夠。但區分1.5倍的拷貝數差異，就需用QuatiStudio 3、QuatiStudio 5、QuatiStudio 6 pro和ViiA7這類有更高分辨精度的熒光定量平臺。而多重實時定量PCR分析更有利于達到所這類實驗所需的辨別精度。

       多重實時熒光定量 PCR實驗技術以來，在基因缺失分析、突變和多態性分析、表達分析和RNA檢測等應用方興未艾。上至Nature、Lancet、Mol Cancer、Neuron、Nucleic Acids Res、Nat Commun、Eur J Hum Genet、J Exp Med、PANS，下至J Clin Microbiol、PLoS One、Am J Pathol、J Mol Diagn等，刊發的Multiplex Quantitative Real-Time PCR assays實驗論文浩如煙海。

表1 multiplex real-time PCR assay應用實例舉隅

 （未完待續）