應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-7

       SYBR Green I是科研qPCR實(shí)驗(yàn)普遍使用的熒光染料。由于SYBR Green I可與包括PCR反應(yīng)非特異性產(chǎn)物在內(nèi)的所有dsDNA結(jié)合，故須在擴(kuò)增結(jié)束后增加熔解曲線分析（Melting Curve analysis）以鑒別qPCR產(chǎn)物特異性，來(lái)驗(yàn)證定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Tm接近的產(chǎn)物對(duì)熔解曲線分辨力要求極高，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的控溫性能和熒光染料屬性的不同無(wú)疑使得鑒別效力有別。有種說(shuō)法是，用SYBR Green I做的qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難被牛刊編審認(rèn)可。若實(shí)情如此，那melting curve analysis豈不白做？

       對(duì)TaqMan熒光探針?lè)╭PCR實(shí)驗(yàn)，MIQE指南要求提供實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程信息、PCR擴(kuò)增效率、檢測(cè)極限(LOD)以及檢測(cè)動(dòng)態(tài)線性范圍。對(duì)Multiplex real-time PCR，須注明每種靶標(biāo)的擴(kuò)增效率和LOD值。

       而SYBR Green I染料法qPCR實(shí)驗(yàn)，指南規(guī)定：要有實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照的Ct值，凝膠電泳、DNA測(cè)序、熔解曲線、擴(kuò)增片段大小或DNA限制性內(nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物特異性［specificity must be validated empirically with direct experimental evidence (electrophoresis gel, melting profile, DNA sequencing, amplicon size, and/or restriction enzyme digestion)］。這里restriction enzyme digestion用“and/or”的表述，說(shuō)明是可選項(xiàng)；而electrophoresis gel, melting profile, DNA sequencing, amplicon size則是必選動(dòng)作。

       那實(shí)際發(fā)文中，人們是如何貫徹MIQE指南的這個(gè)驗(yàn)證政策的？

一、高分期刊論文中qPCR實(shí)驗(yàn)SYBR Green I的使用現(xiàn)狀抽樣調(diào)查

       我們選擇了用Viia7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SYBR Green I染料法，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)表在IF15以上期刊的實(shí)驗(yàn)案例進(jìn)行了調(diào)研。

       以［ViiA7[Text Word] AND PCR[Text Word] AND("0001/01/01"[PubDate] : "2021/09/30"[PubDate])］為檢索條件到3201條論文。篩選IF≥15期刊發(fā)文，對(duì)文章的正文、Supplementary Material相結(jié)合確認(rèn)后，從入選37種期刊（包括了Nat Biotechnol、Nat Med、Nature、J Clin Oncol、Cell、Cancer Discov、Nat Genet、Cancer Cell、Immunity等IF30分以上刊物）中，獲得176篇article。內(nèi)容涉及細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等。再依據(jù)qPCR實(shí)驗(yàn)用SYBR Green I、TaqMan探針?lè)▽?duì)文章分類計(jì)數(shù)。

表1  IF15以上期刊發(fā)表的基于Viia7系統(tǒng)進(jìn)行的qPCR實(shí)驗(yàn)論文列表（2021-09-30） 

       結(jié)果顯示：

       1.1 使用SYBR Green染料法與Taqman探針的qPCR實(shí)驗(yàn)文章數(shù)量分別為113篇（64.20%） 和83篇（47.16%），其中17.04%的實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用了兩種方法；

       1.2 包括Nat Biotechnol、Nat Med、Nature、J Clin Oncol、Cell、Cancer Discov、Nat Genet、Cancer Cell、Immunity在內(nèi)的眾多頂級(jí)影響力期刊，對(duì)使用SYBR Green I染料標(biāo)記法，未顯示歧視跡象； 

       1.3 對(duì)176個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的“聚類”分析顯示，涉及基因表達(dá)相對(duì)定量分析、基因敲除/基因沉默驗(yàn)證、基因絕對(duì)數(shù)量分析、基因分型鑒定、免疫共沉淀-定量PCR分析、miRNA調(diào)控功能分析、基因編輯與修飾水平分析、DNA損失修復(fù)機(jī)制和DNA去甲基化檢測(cè)等共10個(gè)類型。排除Multiplex多重定量PCR、SNP基因分型和臨床樣品病毒載量檢測(cè)，SYBR Green滲透入其他全部應(yīng)用類型。

表2  基于ViiA7系統(tǒng)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分類表  

       這113個(gè)用SYBR Green I染料法進(jìn)行的qPCR實(shí)驗(yàn)中：

       針對(duì)所用引物序列提供了qPCR擴(kuò)增運(yùn)行協(xié)議詳細(xì)參數(shù)者，僅7篇；

       明確注明所用染料的制造商、貨號(hào)者僅一例；

       明確標(biāo)注實(shí)驗(yàn)所用儀器制造商、型號(hào)及反應(yīng)模塊信息者3例。

表3  quantitative PCR assay with melting curves analysis 

        對(duì)表3全部10篇文章的熔解曲線分析步驟所用染料類型及廠商信息確認(rèn)結(jié)果表明，全部染料屬常規(guī)非飽和型SYBR Green I染料。

       其中，Jong Jin Jeong等人用瓊脂糖凝膠電泳+熔解曲線分析兩種方法證明PCR產(chǎn)物的特異性。

       而Britta Will等則采用熔解曲線分析和擴(kuò)增子測(cè)序的驗(yàn)證方法。雖仍不完全滿足MIQE指南的要求，但毋庸置疑，這個(gè)驗(yàn)證流程的可信度最高。  

二、HRM在qPCR中應(yīng)用的特點(diǎn)和技術(shù)要求

       DNA雙鏈長(zhǎng)度一致的情況下，堿基互補(bǔ)的雙鏈熱穩(wěn)定性通常要高于堿基錯(cuò)配雙鏈。熔解曲線分析法是利用不同DNA雙鏈固有的Tm特征，通過(guò)均勻升高樣品溫度，使熱穩(wěn)定性不同DNA由雙鏈依次熔解成為單鏈。而只能結(jié)合dsDNA的SYBR Green I在dsDNA解鏈后，從局部解鏈的DNA 分子上脫落，發(fā)射熒光信號(hào)強(qiáng)度隨之劇減。故通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)升溫過(guò)程熒光信號(hào)的變化，可對(duì)PCR產(chǎn)物中不同DNA組份進(jìn)行區(qū)分。

       高分辨率熔解曲線分析（High Resolution Melt，HRM）技術(shù)源于熔解曲線分析，所不同的是它需依托高分辨率熔解溫度控制裝置和飽和性DNA熒光染料的支持。

2.1 HRM分析用的飽和熒光染料

       飽和熒光染料與DNA結(jié)合的特性不同非飽和熒光染料（最常用的是SYBR GreenⅠ）。高濃度SYBR GreenⅠ會(huì)抑制PCR 反應(yīng)，故在熒光定量實(shí)驗(yàn)中所用濃度很低，無(wú)法達(dá)到使DNA 雙螺旋小溝全部飽和結(jié)合的程度。最關(guān)鍵的是，DNA解鏈過(guò)程中，染料在從已解開(kāi)的呈單鏈狀態(tài)部分片段上脫落的同時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)到臨近的、尚未解鏈的雙鏈殘部并與之結(jié)合（結(jié)合部位重排）而繼續(xù)發(fā)射熒光。DNA雙鏈已開(kāi)始熔解，但樣品熒光強(qiáng)度卻短暫地維持不變，監(jiān)測(cè)的溶解曲線無(wú)法實(shí)時(shí)準(zhǔn)確反應(yīng)DNA解鏈狀態(tài)，對(duì)溫度分辨率降低。

       常用的飽和熒光染料有evaGreen、LC Green/LC Green Plus、SYTO 9、ResoLight等。飽和熒光染料（PCR抑制作用極其微弱可以忽略）可在DNA雙鏈中所有可結(jié)合位點(diǎn)分布，與DNA的結(jié)合呈飽和狀態(tài)。在雙鏈熔解過(guò)程中，尚未解鏈的雙鏈殘部已因無(wú)染料可結(jié)合位點(diǎn)，染料無(wú)法轉(zhuǎn)移重排而從DNA雙鏈上解離，染料熒光強(qiáng)度立即消失。故飽和染料溶解曲線分析熒光信號(hào)變化可以實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確反映DNA雙鏈隨著溫度解鏈情況，據(jù)此有效區(qū)分DNA片段堿基組成的細(xì)微差異。具有高靈敏、高分辨率的特點(diǎn)和善于鑒定純合型序列突變的巨大優(yōu)勢(shì)。

2.2 HRM分析所需硬件支持

       計(jì)算表明，單核苷酸多態(tài)性（SNP）的純合野生型（homozygous wild-type）、純合突變型（homozygous mutant）擴(kuò)增子間Tm存在0.0~1.3℃不等差異。單個(gè)SNP的異源雙鏈DNA（heteroduplex）比最穩(wěn)定型同源雙鏈DNA（homoduplex）的Tm低1.1-3.0℃。單堿基復(fù)合雜合突變序列（compound heterozygotes），與純合野生型序列Tm差異不過(guò)2.8–4.0℃。

? 表4  Human SNP Occurrence and Tm 

        跨越Tm溫差范圍所需時(shí)間相對(duì)于2.2-3℃的PCR變溫速度太過(guò)短暫（最低可設(shè)定為0.050℃/s）。但早期的ABI 7700、LightCycler 1.2/2.0等實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的CCD數(shù)據(jù)采樣間隔高達(dá)數(shù)秒（見(jiàn)《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)通道數(shù)量擴(kuò)充的革命來(lái)啦？》），無(wú)法實(shí)現(xiàn)溶解曲線熒光信號(hào)實(shí)時(shí)采集，更遑論用于HRM分析。

       在HRM技術(shù)初創(chuàng)時(shí)，PCR產(chǎn)物先以20℃/s速率被加熱到90℃，接著以相同速度冷卻到40℃以充分形成各種異源二聚體。再用高分辨率熔解曲線儀將樣品溫度以0.3℃/s的標(biāo)準(zhǔn)速率均勻升高，同時(shí)以不低于10次/℃的采樣密度監(jiān)測(cè)65℃ -95℃范圍熒光信號(hào)變化。市面HRM分析儀CCD采樣頻率高達(dá)100-200次/秒。

       可見(jiàn)，若同時(shí)進(jìn)行96個(gè)樣品HRM分析，則qPCR熱循環(huán)模塊溫控精確性（≤0.3℃）、均一性（≤±0.3℃），軟件需自動(dòng)調(diào)整CCD熒光數(shù)據(jù)采集頻率，以適應(yīng)曲線熔解步驟數(shù)據(jù)檢測(cè)要求。

        早期的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，控溫精度近±0.4℃，孔間溫差高達(dá)±0.4-0.5℃，用于Tm差異2℃以上非特異性二聚體鑒別尚可，無(wú)法勝任復(fù)雜SNP檢測(cè)。

       目前，包括賽默飛ViiA7、QuantStudio 1、QuantStudio 3/5、QuantStudio 6 /7 Pro、StepOne / StepOnePlus、7500 Fastreal-time PCR system，伯樂(lè)CFX96/384、CFX96/384-touch及CFX Opus 96/384real time PCR Detection system在內(nèi)多款實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀，可用飽和型熒光染料和HRM軟件實(shí)現(xiàn)HRM分析功能。

       LightCycler 480II是采用SimplProbe探針進(jìn)行SNP分型鑒定。

三、關(guān)于SYBR Green染料法在qPCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的思考

3.1 SYBR Green I單峰勢(shì)單力薄
       SYBR Green I最早僅限用于Tm相差超過(guò)2℃ PCR擴(kuò)增片段的鑒別。
       對(duì)在囊性纖維化基因I507/F508區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的熔融曲線實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，相同片段，SYBR Green I測(cè)得的Tm值比采用5 –熒光標(biāo)記引物對(duì)照組高2℃。對(duì)長(zhǎng)度41-44 bp的雜合樣本的熔解曲線分析結(jié)果顯示，5 –熒光標(biāo)記引物組圖出現(xiàn)了與預(yù)期一致的兩個(gè)同源雙鏈產(chǎn)物+兩個(gè)異源雙鏈產(chǎn)物峰。而SYBR Green I標(biāo)記組每個(gè)基因型只有一個(gè)同源雙鏈產(chǎn)物峰。
       說(shuō)明，不同基因型擴(kuò)增產(chǎn)物Tm差異減小會(huì)使SYBR Green I分辨力喪失，產(chǎn)物特異性驗(yàn)證失效。憑SYBR Green I染料熔解曲線單峰表現(xiàn)，斷言qPCR擴(kuò)增的特異性顯然不夠。

3.2 HRM高分辯曲線亦須審慎
       基因組水平上單堿基突變引起的DNA 序列多態(tài)性，有同型堿基之間（G-A或T-C）的轉(zhuǎn)換、嘌呤與嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T) 之間的顛換、單個(gè)堿基插入和堿基缺失4大類型。顛換純合突變片段Tm值存在0.8～1.4℃的差異。但轉(zhuǎn)換純合突變片段間的Tm值區(qū)別極其細(xì)微（通常＜±0.4℃），甚至qPCR儀用HRM分析難以分辨。
       此外，隨著擴(kuò)增片段長(zhǎng)度增加，HRM檢測(cè)靈敏度和特異性降低。對(duì)于僅1-2 bp堿基差異大片段分型時(shí)，HRM技術(shù)分辨率是不夠的。
       對(duì)復(fù)雜遺傳背景擴(kuò)增產(chǎn)物特異性驗(yàn)證的可信性，HRM技術(shù)與TaqMan熒光探針是有差距的，不可同日而語(yǔ)。

3.3 MIQE指南所言入木三分
       正因?yàn)镾YBR Green I熒光染料標(biāo)記技術(shù)的固有缺陷，業(yè)內(nèi)對(duì)其在qPCR實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用保持謹(jǐn)慎的態(tài)度。MIQE指南在引物和探針序列經(jīng)BLAST分析驗(yàn)證、擴(kuò)增結(jié)束引入熔解曲線分析基礎(chǔ)上，要求對(duì)qPCR產(chǎn)物特異性引入凝膠電泳甚至基因測(cè)序?qū)嶒?yàn)確認(rèn)。但時(shí)至今日，學(xué)界對(duì)MIQE指南規(guī)定的qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證的技術(shù)方法意見(jiàn)依然不統(tǒng)一。
       SYBR Green I、LC Green、evaGreen、SYTO 9等熒光染料標(biāo)記法對(duì)于qPCR實(shí)驗(yàn)，當(dāng)用盡用，毫無(wú)疑問(wèn)。
       熔解曲線或HRM分析之外增加PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶專一的驗(yàn)證，確是MIQE力挺的。雖有可能招來(lái)“沒(méi)必要”這類善意“中評(píng)”，但應(yīng)祝賀！因?yàn)閷?shí)驗(yàn)者對(duì)qPCR驗(yàn)證的思想境界顯然已對(duì)標(biāo)Cancer Discov刊文作者啦！

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