悟凝膠成像儀性能為圖像分析開新局-4

       菌落(colony)又稱細菌集落，是由同種微生物的單個菌體或孢子在一定培養條件、一定固體培養基上生長繁殖后形成的肉眼可見的聚集體。

       現行國標規定：可手工或用菌落計數器測定菌落的數量，計數單位為CFU (colony-forming units)，以cfu/g或cfu/mL值表示被檢樣品的微生物菌落總數。

       凝膠成像分析系統，除主要用于常規電泳凝膠圖像采集與分析外，廠家技術資料常提及Colony counting，即細菌菌落計數、克隆計數功能。但實際工作中，用凝膠成像分析儀進行克隆計數的較為少見。這是因凝膠成像分析系統在菌落計數功能上存在諸多短板難以滿足計數要求，還是緣于業內長期以來菌落計數使用習慣所致？

一、國家技術標準對菌落計數的要求
       現行國家標準文件中的微生物菌落總數檢驗的規范流程規定，可用肉眼或放大鏡輔助觀察法直接標記計數，或采用菌落計數器進行計數。
       其中有兩個文件的局部內容與菌落計數器的使用有關。
1.1 《醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法》
       《醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法》中的菌落計數部分規定：
       【細菌種類繁多、差別大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落。】
       【平板上2個或多個菌落重疊，若可區分開則應以2個或多個菌落計數。】
       可見，菌落計數器的使用至少有三個要點：
       菌落計數用光源：透射或反射白光源均可滿足要求，透射白光更佳；
       菌落計數選區設定：選區范圍應覆蓋培養皿底部整個培養面；
       重疊菌落的分割：對距離近而相互粘連菌落的分割計數。

1.2 菌落計數器校準規范
       盡管菌落計數器的技術性能、使用規程尚無國家標準。但已先行頒布了《JJF 1751-2019 菌落計數器校準規范》。
       規范所列的菌落計數器校準事項中包括：
1.2.1 菌落計數器功能
       菌落計數器是可對經處理培養皿上菌落自動分析計數的儀器，由光源、CCD圖像傳感器、圖像處理系統及計數顯示設備等。分析時彩色圖像傳感器獲取培養皿圖像，專業軟件對圖像中的菌落進行分析識別和統計,從而獲得培養皿上的菌落總數。
1.2.2 校準規范適用范圍
       適用于具有掃描成像系統并根據圖像自動進行計數的菌落計數器及其他類型的菌落計數器的校準。
1.2.3 菌落計數儀器校準項目
       鑒別力：用儀器可識別的最小菌落的直徑表示菌落計數器的最小菌落的識別能力。
       分辨率：數碼成像系統或成像組件分辨圖像細節能力。

二、凝膠成像分析系統的硬件實力
       正如《如何有效評價凝膠成像分析系統的技術性能-透射白光的配置應用》文中所述，凝膠成像分析系統通常標配有反射型白色光源，還可視實驗需要加配透射型白光光源。

       凝膠成像系統再充分發揮自身高分辨率圖像采集功能，故硬件上足以滿足常規菌落計數應用的技術要求。
1）應用的合理性
       凝膠成像分析系統的硬件組成、圖像采集和分析工作模式，已具備《菌落計數器校準規范》界定菌落自動計數類儀器的全部特征和功能。因此，是可以名正言順地納入菌落計數類儀器范疇的。
2）技術的可行性
       多數菌體的單體需借助光學顯微鏡放大數十倍后才能現形。但成千上萬的細菌聚集生長形成的菌落，則足以憑肉眼即可輕松分辨和觀察。資料顯示，按食品安全國家標準食品微生物學檢驗規范指定培養條件，金黃色葡萄球菌所形成的圓形菌落直徑2-3mm。而經驗表明，大腸桿菌經LB培養基37℃培養18小時所形成菌落的直徑可達1.5-2.0mm。
       就凝膠成像分析系統的圖像分辨能力看，早在2000年前后上市的伯樂Gel Doc 2000系統（CCD分辨率768H×494V像素，最大成像面積25×26cm），對應于被分析樣品上，其幾何尺寸區分能力就已達0.5mm，足以分辨直徑1.0mm大小的實驗培養菌落。而新型凝膠成像分析系統，如伯樂GelDoc Go凝膠成像分析儀（630萬像素，最大圖像區域14L×21W cm），國產勤翔GenoSens 2000系列凝膠成像分析儀（605萬像素/2048×2560 pxls、最大圖像區域19L×26W cm），對實物上兩點間距的分辨能力已升至0.1mm以內，這對于可靠捕獲絕大多數實驗培養菌菌落圖像的任務，已是綽綽有余。
       因此，在凝膠成像分析系統上進行常規菌落計數工作，可謂合情合理，水到渠成。

三、凝膠成像分析系統的菌落計數功能原理
       凝膠成像系統圖像分析軟件的菌落計數功能，是基于靈活高效圖像采集控制與強大的圖像分析能力實現的。
       圖像分析系統對菌落的識別與常規電泳凝膠圖像中泳道和條帶的自動識別，原理異曲同工。都是在劃定的選區內基于分析對象與圖像背景的灰度值差異來對目標所處位置、面積大小和色彩進行自動識別與統計。
       在菌落計數中，軟件對培養皿上的菌落與周圍培養基區域的局部像素強度值峰和信號分布范圍，結合人工設定的強度閾值（density thresholds），完成對菌落判別、顏色的區分、直徑大小以及菌落數量的自動統計。

 （待續）