悟凝膠成像儀性能為圖像分析開新局-3

一、白光光源在凝膠成像分析儀中的配置
       資料顯示，國內外凝膠成像分析系統廠家，在考馬斯亮藍染色、銀染等可見光凝膠成像分析應用中檢測光源的配置問題上，意見是不一致的。
       譬如Alpha公司的經濟型凝膠成像系統AlphaImager EP，標準配置為反射白光雙側白光燈（Epi white lights），透射白光板作為選配件。而經典型AlphaImager HP凝膠成像分析儀、AlphaImager FluorChem HD2 WB成像分析系統、FluorChem MWestern Blot印跡膜多色熒光成像系統，則同時將雙側反射白光光源和透射白光板（white light table）作為系統標配。
        UVP公司BioDoc-It 2 Imaging Systems普及型凝膠成像儀標配雙側反射白光光源，透射白光板（White Light Plate）為選配件。高端BioSpectrum Imaging System凝膠成像分析系統，則兼有反射型白光照明（Epi Illumination）、LED白光透射儀（LED White Light Illuminator）兩種白光光源。
       伯樂經典Gel Doc XR+ 凝膠成像分析系統，標準白光光源包含透射白光板（White Light Transilluminator）和反射白光照明（epi-white illumination）。而GelDoc Go凝膠成像儀提供反射白光（Epi-white）做基礎白光光源，把紫外轉換型透射白光樣品盤（optional white tray）作視為非必需件。
       標準配置只提供雙側LED 白光反射燈的現象，在進口Axygen GD-1000/GDBL-1000凝膠成像分析儀、國產勤翔GenoSens 2000系列凝膠成像分析儀、天能Tanon 1600凝膠成像儀上都可被觀察到。

       通常認為，雙側LED 白光反射燈在凝膠成像中主要用于考染、銀染等蛋白質電泳膠的觀察和拍攝；此外，在上樣時作為照明調整樣品位置以及鏡頭的精確對焦。
      而亮考染色、銀染蛋白質電泳凝膠觀測的功能，與透射型白光光源作用是一致的。
      既然反射白光就能滿足蛋白凝膠可見光成像需要，為何不計成本、多此一舉，還要開發透射型白光板？到底反射白光與透射白光作為檢測光源應用上有何本質區別？
      在回答前，先看看圖像分析領域的權威軟件關于反射和透射光源在圖像量化分析中應用要求。

二、ImageJ軟件用戶指南關于反射和透射光源在圖像量化分析中應用要求
      在ImageJ軟件用戶指南的《XXIV Using Scanners in Densitometry》附錄說明中有如下內容。
    【Electrophoretic gels such as Western blots need frequently to be quantified in order to translate biochemical results into statistical values. Independently of the measurement method, you should be familiar with the Beer–Lambert law, so that you are aware that the optical density (absorbance) of the staining to be measured must be proportional to the concentration of the probed material.】

    【Samples must be scanned in transmission mode.】

    【Scanners can only serve as densitometers if the light source and detector are on opposite sides of the instrument (transmission mode). This is critical for quantitation of absorbances and requires an adapter for transparencies or negatives to be mounted or built-in on the scanner.】

    【Most flatbed scanners have the light source and detector located on the same side of the instrument (reflection mode). Under these conditions, light interacts with semi-transparent objects in a complex manner with reflected light re-passing through the object on its way to the detector.In addition, thick samples (such as Coomassie-stained gels) are imaged from the surface under reflection light.】

      概括起來，可以這樣解讀：
      1）常規染色后核酸蛋白質電泳凝膠圖像量化統計分析，前提須是條帶染色后的光密度（吸光度）大小與被檢測樣品的濃度成正比。這樣才符合Beer–Lambert定律；
      2）樣品必須以透射光模式進行掃描
      只有當檢測光源和光信號探測器位于被檢測樣品的兩側，光線直射穿透樣品后進入掃描儀探測器獲得的圖像，才能作為樣品光密度的量化依據。這對于吸光度檢測至關重要。
      3）反射式檢測光源不符合Beer–Lambert定律應用要求
      大多數平板掃描儀，由于光源和探測器位于被檢測樣品的同側，屬于反射模式掃描。
      在反射條件下，光以復雜方式與半透明的物體相互作用，經歷多次反射、透射后進入探測器，檢測器接收的反射光信號成份十分復雜。考馬斯亮藍染色蛋白凝膠等物品存在一定厚度且對光通透，而凝膠表面會反射檢測光線。垂直射向凝膠檢測光線會有多次反射、透射，探測器采集的染色圖像不能真實代表凝膠樣品實際對透射光的吸收程度。因而，反射模式下樣品成像不可作為凝膠圖像和X-射線膠片量化分析的依據。
      我們把ImageJ圖像分析軟件指南中的規則應用于凝膠成像分析系統中，得出如下推論。
      A）雙側反射白光，只能為亮考染色凝膠觀察與拍攝提供基礎照明作用，但反射光呈現的圖像染色深淺與凝膠中樣品實際含量并無直接關聯。基于反射光成像獲取的凝膠圖像，不可作為樣品中蛋白定量的依據。
      B）按照Beer–Lambert定律，檢測光線須是直射穿透檢測樣品，入射光線力求平行而均勻。如需基于樣品圖像進行樣品含量量化分析，只能采用透射模式下采集的圖像。
      因此，對于根據染色來評估蛋白表達峰度的實驗應用，透射白光光源的配置是必要和科學的。譬如，在蛋白組學雙向電泳實驗中，2D凝膠的透射掃描就是不可或缺的環節。
      當然，凝膠光密度分析結果特異性，相對于Western Blot實驗借助于蛋白印跡免疫檢測技術，的確不可同日而語。
      C）凝膠成像分析系統配置的透射型白光光源，除了可用于蛋白凝膠的成像定量分析，還可用作X線檢測底片的掃描成像，如臨床醫學X線、CT和MRI體檢底片，Western Blot實驗采用放射線自顯影檢測技術獲得底片等影像資料。

三、小結
      總結起來：凝膠成像分析系統標配反射白光光源是實用的；如需對凝膠染色后定量分析，或需對包括采用放射自顯影路線獲取WB實驗檢測底片等X射線影像資料進行量化分析，配置透射型白光光源具有重要使用價值。

參考文獻
［1］FluorChem HD2 and FC2 User Guide，Revision 2（P/N 94-15068-00）
［2］BioSpectrum Imaging System Instruction Guide 81-0207-01 (Rev. O)
［3］ImageJ User Guide_IJ 1.46R