悟凝膠成像儀性能為圖像分析開新局-4

四、凝膠成像分析軟件的菌落計數分析功能類型
       歸納起來，專業凝膠圖像分析軟件可提供多種菌落定量分析功能，滿足不同類型微生物菌落檢測需求。
4.1 自動計數、預設模板計數和手動計數
       自動計數功能（Automatic Counting）：調整好圖像大小，使用矩形、橢圓、多邊形工具定義分析區域范圍，選擇"自動計數"菜單，系統將自動完成選區內全部菌落計數，并在圖像上顯示。
       與之類似，在預設模板分析模式（Template Counting）下，調用預設條件模板，軟件將按模板設置要求自動完成菌落分析統計。
       手動計數（Click and Add Counting），人工肉眼識別圖像上的菌落，手工逐一“點選”，被選中的菌落自動突出顯示并以數字標示，在完成菌落計數后，軟件給出計數圖像分布與統計結果。

4.2 顏色分類計數
       菌落外形特征是辨認菌種的重要依據。細菌、酵母、霉菌等不同類型微生物，在不同培養基上形成外觀特征，如菌落大小、形狀、邊緣、顏色、光澤和透明程度等，存在差異。而同種細菌、在相同培養條件下形成的菌落特征具有穩定性。
       在Identify by Color Counting計數模式下，軟件可按顏色區分不同菌落，并根據顏色屬性分類統計。一次分析可完成培養皿中不同類型菌落檢測計數。
       在定義計數選區，選中第一重顏色菌落后，系統自動識別和計算所有與采樣點相同顏色的菌落。通過分類添加操作，可進一步定義和自動分析其他菌落類型，直至完成選區的全部菌落。

4.3 區帶分析
       區帶分析（Zone analysis）功能可提供圖像選內各個獨立菌落分布范圍的面積、直徑大小統計信息，常用于抗菌和抑菌效果評價實驗中被檢樣品的抑制圈直徑大小的測量等檢測。

4.4 選區排除計數
       國標對于菌落計數選區的選擇有明確技術要求。
       《食品安全國家標準食品微生物學檢驗-菌落總數測定》規定：以無片狀菌落生長的平板進行菌落計數；若成片狀生長的菌落比例不到平板培養面積的一半,而另一半區域菌落分布均勻,則可計算半個平板后乘以2,代表該平板菌落總數。
       如培養皿的特定區域圖像有污損，不符合計數要求，或實驗者不想將這部分菌落列入最終計數結果中，則可通過某些在凝膠成像分析軟件的"忽略區域"命令（Ignore Region），將該圖像區域排除在計數選區外。
       經驗人士指出，實驗中應盡量避免在培養皿的底面寫字標記。除非在計數前圖像經適當處理消除字跡，否則字跡部分會被錯誤地識別為菌落，干擾計數結果。

4.5 螺旋平板計數
       螺旋接種法，是政府微生物專業檢測機構、食品藥品和化妝品生產企業進行樣品菌落總數檢測、培養基質控中常用接種手段，已被FDA、AOAC、APHA、ISO 7218、我國GB 4789.28-2013及SN/T 2098-2008等收錄。
       螺旋板計數功能，Spiral Counting，正是針對螺線平板接種法開發的自動計數模塊。
       執行螺旋板分析命令，系統生存一張阿基米德螺旋形網格疊加在計數圖像上。移動和調整網格到大小和位置實現螺旋網格中心與螺旋平板圖像中心準確對齊，軟件將顯示螺旋板分析窗口并可自動顯示計數結果。

4.6 計數條件設定和修正
       《醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法》規定：
       1）須區分細菌菌落或培養基沉淀物，剔除被錯誤識別為菌落的圖像背景計數；
       2）平板上有2個或多個菌落存在重疊，在可有效分辨的情況下應按2個或多個菌落計計算。
       為確保菌落計數器或人工計數結果的準確性、減少誤差，需設定合理分析條件，且在必要時執行增加/刪除、分割（Split Colonies）/合并菌落（Merging Colonies）操作。
       凝膠成像分析軟件的菌落計數模塊，設置有多個計數條件設置選項和修正計數功能，足以勝任菌落計數過程的質控管理任務。
4.6.1 菌落分割/合并功能
       當兩個或多個菌落距離太近而被軟件識別為一個菌落時，可通過Manual Split Colonies命令手工操作或借助于Auto Split Colonies命令自動實現黏連菌落的分割。
       當一個菌落被錯誤地識別為兩個獨立菌落時，可以通過Merging Colonies命令手動合并兩個菌落。

4.6.2 菌落圖像強度閾值設置
       軟件的自動計數是基于分析對象與圖像背景的灰度值的差異，如培養皿上菌落比周圍區域更暗或更亮。而圖像強度閾值（Density Thresholds）設置規定了分析對象圖像灰度值的范圍。軟件將圖像中像素強度處于高、低兩個閾值之間的分析對象視為細菌菌落統計，提高計數準確性。

4.6.3 設置菌落大小尺寸
       圖像分析對象大小不同，如僅需對特定大小的菌落計數，可使用區域控制（Area Controls）命令，設定被統計菌落的直徑大小范圍，則直徑值處于設定區間的對象視為計數對象。

4.6.4 用直方圖區分菌落
       凝膠成像分析軟件菌落計數模塊，可用直方圖顯示檢測到的全部菌落圖像信號強度分布范圍。如果圖像中有白色、藍色兩種菌落，則直方圖上會顯示兩個清晰信號峰。
       直方圖計數窗口設有控制滑塊，可設置菌落-圖像背景、白色與藍色信號強度值界限。拖動滑塊時，菌落數量、白色、藍色菌落的數量將自動調整。

五、討論
       凝膠成像分析軟件依托自身強大圖像量化分析算法，為菌落計數提供了全面的菌落分類和量化信息，包括菌落的種類數、每類菌落數量和類百分比；菌落整體和每類菌落的面積、菌落周長、菌落平均直徑和菌落圓度(numerically depicts roundness of the colony)統計數據等。就功能和適用性而言，與全自動菌落計數儀難分伯仲。因此，充分發揮實驗室既有凝膠成像分析平臺資源，開展常規微生物菌落計數工作，科學合理，簡便易行。
       無須諱言，不同品牌凝膠成像分析系統軟件集成的菌落計數功能模塊種類、數量存在區別，分析條件設置要求也不盡相同。
       此外，凝膠成像分析系統自身硬件條件所限，無法使用新型自動菌落計數儀裝備的暗視野底部透射光源（下光源），菌落表面立體細節呈現效果不佳。部分機型LED反射白光色溫偏冷，一定程度上影響對菌落真實色澤的還原。

參考文獻
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［2］ GB/T 16293-2010 醫藥工業潔凈室(區)浮游菌的測試方法
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