悟凝膠成像系統性能為圖像分析開新局-1

      從本篇開始，我們開啟《悟凝膠成像系統性能為圖像分析開新局》系列專題，通過總結分析凝膠成像分析儀各組成模塊的現狀和演變，以便全面有效評價凝膠成像分析儀的技術性能。同時，嘗試進一步發掘凝膠成像儀的功能應用，讓這款經典儀器為實驗樣品圖像分析開創新局面。
      凝膠成像分析儀，是集凝膠成像暗箱、檢測光學組件、圖像采集單元、電腦操作控制單元等硬件模塊于一體，在圖像采集和分析軟件控制下，采集核酸蛋白電泳凝膠、細菌培養皿、多孔板等多種實驗載體樣品的圖像，并可調用隨機軟件相應功能插件對圖像進行定量、半定量分析的綜合軟硬件復合系統。
      因此，凝膠成像分析儀又常被稱作凝膠圖像分析系統（Gel Documentation Systems）。如Axygen的GD-1000 Gel Documentation Systems，伯樂的 GelDoc Go Gel Imaging System，賽默飛E Gel Imager Gel Documentation System及國產勤翔公司GenoSens 2000凝膠成像分析系統等等。
      凝膠圖像分析前提是圖像的數字化。
      所謂數字化圖像（Digital Images）是用沿著x軸（行）方向和 y軸方向（列）方向排列若干正方形像素/像元（Pixels/picture elements）定義圖像寬度、高度和每個位置像素強度值的二維網格像素陣列（two-dimensional grids of pixel intensities values）。
      數字化圖像生成離不開CCD和CMOS這兩個常用的圖像傳感器。傳感器由數十至數百萬個具有光電轉換和電荷存儲功能的像素組成。它利用感光二極管將每個像素收集的光子通過光電轉換累積儲存電荷，再經模數轉換器ADC將電信號轉換為圖像的數字信號后壓縮保存或傳輸到計算機存儲分析。

      正是基于CCD在圖像快速捕獲與存儲中的核心地位，考核評價凝膠成像分析系統的性能，通常可從審視CCD的技術性能開始。

一、衡量CCD技術性能的基本要素

1.1 CCD像素數量

      數字相機的傳感器由數十萬至幾千萬個像素呈棋盤狀排列組成。相機的分辨率是指CCD或CMOS成像傳感器所采集到的單個水平像素（M）與垂直像素（N）的數量總和。傳感器的分辨率越高，成像后的圖像像素越高，圖像輪廓細節就越清晰。

      相機分辨率要根據需求而定，并非分辨率越高越好。高分辨率圖像的數據量大，聯機的圖像傳輸速度幀率(Frames Per Second，FPS)就迅速下降，圖像顯示動作遲滯欠流暢。目前，與熒光顯微成像系統動輒1000-2000萬像素的成像單元比，市面主流凝膠成像系統還以300-600萬像素CCD為主。

1.2 CCD像素尺寸

      CCD傳感器分辨率還受像素尺寸大小的制約。像素尺寸（像元尺寸）是指一個像素在長和寬方向上所代表的實際大小，尺寸以2-20μm居多。圖像大小一定的情況下，像素尺寸越大，分辨率越低，圖像清晰度越低。像素尺寸小，相機的分辨率增加，有利于對細小缺陷的檢測和增大檢測視場。

      像素尺寸大小與圖像像素計算公式為：

      據此推導出以下公式：

      公式2說明：圖像中一個像素點表示的實際距離 = 像元尺寸/放大倍數（備注：凝膠分析系統中CCD鏡頭常用的放大倍率有0.35X、0.5X、0.7X，實際是縮小圖像而非放大）。因此，像素尺寸7μm的相機對圖像分辨率不如4μm的相機。但不能據此認為，像素尺寸越小越好，還應根據樣品成像場景要求而定。

      相機的像素在曝光過程中吸收光子轉換為電子。感光區域越亮，收集到的光子越多，積累的電荷量也越大。沒有吸收光子和吸收光子至滿載的像素值分別顯示為"0"和"255"，即代表圖像純黑色和純白色。每個像素接受光信號的過程叫曝光，所花的時間叫曝光時間。

      CCD傳感器像素在受到強光照射時，亮點區域像元獲得的光照過強，光電二極管產生的光電子數超過CCD電荷容量而溢出，此時溢出的電子將沿行或列方向進入相鄰像素，導致在過飽和的像素點附近錯誤的像素信號值，被“污染”的相鄰圖像區域出現光暈（Blooming）效果。

      像素面積縮小，能儲存的電荷量隨之減小。一旦像素滿載便會溢出。高光溢出使鄰近像素發生“快速充電”，但其實并非因接收光子光電轉換的真實值。結果是，圖像高光區域部分的信息損失。若采用減少曝光時間來防止高光溢出的辦法，則會造成對應于昏暗環境的像素曝光時間不夠，得到的像素值太低，這樣會導致圖像昏暗部分信息缺失。

      而大尺寸感光元件的像素電荷容量大，不易因延長曝光時間而被“填滿”，因此，與昏暗環境對應的像素在描繪明亮環境的像素“滿載”之前，有更多時間吸收光子，確保畫面明暗均衡，實現“淡妝濃抹總相宜”的美好境界。

1.3 CCD像素動態范圍

      動態范圍(Dynamic Range)是物理學中表示某一物理量最大值與最小值的比率，通常以對數表示，單位默認情況下用分貝(dB)表示，也可以用比特(bit)或擋來表示。就CCD測量而言，動態范圍通常是指CCD的最大信號電平與讀出噪聲電平之間的比值。

      對于真實場景，是指最亮處與最黑處的亮度之比。某一場景的動態范圍很廣,就是說場景中從陰影部分到高光部分之間的曝光數值相差很大。一般來說，低動態范圍的相機噪聲比較多，照片會缺失亮部細節和暗部細節。而寬動態范圍有利于將場景中極亮和極暗部分細節同時被清晰地顯示，畫面的對比度高。

      當拍攝不同應用場景的圖像時，有兩個動態范圍是需要考慮的：一是要拍攝場景的動態范圍，二是相機的感光元件的動態范圍。因此，應盡可能地是相機的動態范圍與應用場景的動態范圍匹配，以確保圖像的亮部細節和暗部細節都完美展現。

      小尺寸像素因光電溢出效應，造成相機動態范圍的降低。而大尺寸像素設計，使相機具有更大動態檢測范圍。

      芯片的動態檢測范圍擴大，使成像系統可同時應對微弱信號條帶、高亮度條帶的檢測能力得到質的飛躍，特別有利于復雜的科研實驗圖像分析。

      目前，芯片的動態檢測范圍從早起的1.8已擴展到3.5-4.0個數量級。

1.4 CCD像素深度

      像素深度（Bit–Depth）是指相機存儲每個像素值（intensity of pixel）所用的Bit位數。它決定灰度圖像的每個像素可能有的灰度級數（gray levels）或者決定彩色圖像的每個像素可用的顏色數。每個像素的比特位數多，圖像顏色更接近實物本身。最常見的像素深度有1-bit、8-bit、16-bit、24-bit和32-bit。

      8-bit像素灰度圖像（gray image），從最暗黑色到最亮的白色，共有256級灰度可定義。如彩色圖像的R、G、B三個色彩分量用固定5-bit表示外加1位屬性(Attribute)位，則一個像素的深度為16-bit。如每個像素的R、G、B三個分量每個均為8-bit，則像素深度為24-bit，每個像素可代表224次方種顏色中的一種，對色彩的變現力將極大改善。

      通俗地講，像素深度代表的是相機圖像色調的再現表達能力。

二、凝膠成像分析系統CCD的技術迭代歷程

      縱觀近20年凝膠成像分析儀技術發展，顛覆性革新就發生在CCD成像單元。

      伯樂凝膠成像分析儀為例，抽取20年前-10年前-目前三個代表性機型，基于官方公開發表技術資料，匯總了不同年代CCD主要性能指標表。

表1  2000-2020年伯樂公司凝膠成像系統CCD主要性能指標對比

      表1表明，20年間，隨著半導體和大規模集成電路設計制造工藝進步，CCD的像素尺寸經歷了9.8μm、4.65μm、2.4μm瘦身過程。成倍縮小的像素使得在相同尺寸芯片集成更多像素稱為可能，推動著凝膠成像分析儀的CCD像素數量一路高歌猛進，從20年前40萬像素升至130萬像素，又再從400萬像素飆升到目前的630萬像素。

      近年上市的美國賽默飛Invitrogen iBright CL750 Western blot凝膠成像分析系統 的CCD圖像分辨率更是高達910萬像素（3380×2704 pixels,像素尺寸2.69μm×2.69μm)。

      CCD像素的增加不僅使圖像輪廓細節刻畫得更細膩，在對選區的定量分析中，有助于提高選區面積和區內像素強度值的計算精準性。

      CCD動態檢測范圍的擴大不僅有利于不同部位光線強弱懸殊的樣品圖像的完美兼容，還擴大了對不同類型屬性樣品的檢測適用范圍。

      CCD像素深度的演變，提高了CCD檢測靈敏度，使不同條帶量化數值更精確。16-bit像素深度計算處理能力，使圖像從黑白的混沌豁然迎來五彩斑斕的境地。

參考文獻：

1. Bio-Rad Quantity One Version 4.4 User Guide RevA (4000126-14)

2. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)