悟凝膠成像系統性能為圖像分析開新局-2

凝膠成像分析儀的CCD/CMOS傳感器，尺寸以1/2、3/4和1英寸多見。這里的尺寸是指CCD感光靶面的對角線長度。但與電腦和手機屏幕尺寸用的單位英寸(inch)不同，CCD行業換算標準為1英寸為16mm而非25.4mm。常用的3/4英寸CCD對角線折合約12mm，外觀大小跟手指甲蓋面積相仿。

無論Wide Mini-Sub GT寬式水平電泳槽 灌制的7×7cm核酸凝膠，或伯樂Mini-Protean Tetra蛋白垂直電泳槽用的10.1×7.3cm小型SDS-PAGE蛋白凝膠，尺寸都遠超傳感器感光面有效尺寸。更不用說凝膠成像分析儀可容納1-4塊7×7cm或7×10cm小型凝膠同時成像，成像區域寬20-26 cm×縱深14-22cm，物像尺寸比高達30-40倍。

孫悟空憑神乎其技的縮骨換形本事，才能鉆進鐵扇公主的肚子里完成“說走就走的旅行“。CCD要采集完整樣品區圖像，得靠光學鏡頭高效收集、匯聚來自拍攝對象的光線，形成清晰的縮小實像并精準投射在感光靶面上，才居高臨下“一覽眾山小“。

光學鏡頭不僅對CCD成像效果發揮基礎決定作用，還對凝膠成像分析儀的機箱內部空間高度有密切關系。

1、鏡頭的明眸善睞-光圈系數

數值孔徑是衡量光學鏡頭能收集光的角度范圍的指標，等于透鏡與被檢物體間介質折射率（n）和孔徑角（2θ）半數的正弦之積，即：NA = n × sinθ。

孔徑角是透鏡光軸上的物點與透鏡有效孔徑直徑(DEP)形成的夾角。孔徑角越大，鏡頭的光通量就越大。凝膠成像系統中，鏡頭數值孔徑NA =sinθ。如圖所示，NA與有效孔徑直徑(DEP) 或通光孔徑D成正比，與焦距成反比。

在攝影行業，通常都是用“光圈系數”（f-Stops/f-系數）” 表示鏡頭的通光能力大小。光圈系數f/#與NA為反比關系，即 NA=1/[2(f/#)]。f/#越小，則NA越大。

在鏡頭上標記的數值f/1、f/1.4、f/2、f/2.8、f/4、f/5.6、f/8等，正是鏡頭的最大光圈系數f/#。鏡頭f/#越小，代表鏡頭通光孔徑越大，可采集到光線（通光量）越多，更容易發現弱信號樣品。

目前，普通凝膠成像儀用的鏡頭為f/1.2、f/0.95，而同時具有Western Blot印跡膜ECL成像與凝膠成像功能的成像系統，為增強檢測微弱信號檢測能力，鏡頭光圈系數為f/0.95 、f/0.8甚至更低。如Invitrogen iBright CL1500熒光化學發光凝膠成像分析系統為f/0.95，ChemiScope 6200熒光及化學發光成像系統為f/0.8。而GE最新的Amersham ImageQuant 800多功能成像儀搭載是f/0.74定焦鏡頭。

光圈系數不僅限于控制光通量，還與光學分辨率有關。f/#值越低，對細微結構細節分辨和條帶邊緣輪廓細節呈現得越清晰。

考核和比較不同型號凝膠成像分析儀成像技術性能，可先從攝像鏡頭f/#值開始。

2、鏡頭的縮放自如-焦距

2.1鏡頭變焦 VS 定角

關于成像鏡頭焦距類型對曝光速度的影響問題，Alapha官方資料中提到：對Western/Slot Blot樣品成像，FluorChem HD2 成像系統使用超級定焦鏡頭（Manual 50mm, f/0.95 fixed lens）來增加光信號收集速度，縮短成像時間；在化學發光檢測中，用變焦鏡頭的系統往往需要更多曝光時間才能得到合適的圖像。

這里提出2個論點，一是光學鏡頭有定焦鏡頭（fixed lens）和變焦鏡頭（zoom lens）之分，二是定焦鏡頭曝光速度高于變焦鏡頭。我們不妨展開來探討一下。

定焦鏡頭只有一個固定焦距鏡頭，常規攝影中常用的有8mm，15mm，24mm，28mm，35mm，50mm等多種。所謂“對焦”和“調焦”，是指用鏡筒上對焦環細微調整鏡頭與感光元件間成像距離，使拍攝成像清晰。

定焦鏡頭因為內部結構相對簡單，鏡頭口徑往可以做得更大，數值孔徑NA增大（光圈系數較小）后，鏡頭光通量自然更大。“快鏡頭”光圈很大，指的正是定焦鏡頭。

變焦鏡頭是在一定范圍內可以變換焦距的鏡頭，通常是由很多個定焦鏡片排列組合而組成復雜結構，如28～200mm鏡頭就集廣角、標準和中、長焦距為一體，包含了6-7個定焦鏡頭。可通過旋轉鏡頭筒上的變焦環調節鏡片內部之間距離，以保證不同遠近對象都能形成清晰影像，復雜的內部結構制約了鏡頭總體數值孔徑的提升，光通量提升空間極為有限。

由此，我們就容易理解所謂的定焦鏡頭“快”和“曝光時間短”的涵義了。

表1  凝膠成像系統鏡頭分辨率-焦距-成像區域指標對比

從表1，我們可更直觀地看出定焦鏡頭和變焦鏡頭應用的區別。凝膠成像分析儀用的是光圈系數f/1.2的8-48mm變焦鏡頭。而具有Western Blot化學發光成像功能的Invitrogen iBright CL1000印跡膜與凝膠多功能成像系統，用的則是25mm固定焦距光圈系數f-0.95的鏡頭，其目的就是為了“快”。

2.2 鏡頭焦距與成像大小

凝膠成像分析系統可檢測樣品呈多元化，不同樣品和不同操作習慣，樣品托盤不同，物品與鏡頭距離存在區別。

根據透鏡成像公式，焦距確定后，選定拍攝對象即確定了物距，此時通過對焦環調整透鏡和感光元件間距可確保成像清晰。這個過程稱為對焦(focus)。可由手動完成（“手動對焦”），也可以是相機自動完成（“自動對焦”）。

譬如，同一塊EB染色瓊脂糖DNA凝膠，可直接置于紫外臺上，也可裝于凝膠托盤再轉移至紫外透射臺觀察；紫外透射臺疊加藍光轉換板用于SYBR Safe凝膠觀察；紫外臺上添加白光轉換板，可用于考馬斯亮藍蛋白凝膠檢測。不同操作習慣和不同應用，會造成物距不同，無論對定焦還是變焦鏡頭，都需通過鏡頭對焦環微調像距，以確保圖像清晰。

物距U減少，對于固定焦距鏡頭，像距V增加，結果是圖像與拍攝對象比例增加，即圖像得到放大。但因像距存在f < v <2f限制，故鏡頭上下可調范圍小于1f。因此，短焦距定焦鏡頭，對焦只能解決圖像質量問題，圖像光學放大能力極為有限。

要放大圖像需加大焦距。對同一距離同一個目標拍攝，短焦距鏡頭所得圖像小（成像視野大），長焦距鏡頭所得圖像大（成像視野小）。變焦鏡頭通過調節鏡頭的焦距來采集不同大小的影像和不同取景范圍。譬如先用18mm焦距拍攝得凝膠成像儀整個成像區域全貌預覽，再調整為50mm焦距拍照，但拍攝樣品圖像得到放大。這個功能稱為縮放圖像功能（Zoom）。

2.3 Zoom功能的應用價值

用凝膠成像分析儀采集實驗圖像目的無非是用于圖像調整處理分析和發文審核。目前SCI期刊插圖排版分為半版(8.0cm)，2/3版(14cm)和整版(17cm)三種形式。

根據人體工程學原理，如使用18.5英寸顯示器臺式機或14英寸筆記本屏幕的水平×垂直分辨率為1366×768像素(1920×1080像素)，無論是提審還是在線瀏覽，計算表明：半版圖水平分辨率達到384像素(560像素)，且垂直分辨率不高于618像素(869像素)時（否則圖像會被按比例縮小顯示)，視覺體驗最佳。最大成像區21×16.8cm的凝膠成像儀生成可供發表的8.0cm圖像，CCD分辨率應不低于1.36 MP，否則實施數碼放大后，圖像美感要大打折扣。

有網友認為，發表JPG/TIFF圖片分辨率不低于300dpi以400-500dpi為宜。這顯然是把打印機的Dot和電腦顯示的像素(Pixel)混為一談，但也說明發表圖像分辨率確應從源頭上引起重視。

阿拉斯加科技近期完成了一項的專題調研，意在統計2016年1月-2021年1月發表的采用電泳凝膠圖像數據的SCI期刊論文情況。結果顯示Science、Cells、Nucleic Acids Res、PANS、Genetics、J Biol Chem、Pharmaceutical Biology等都有相關文章。

2016.01-2021.01 SCI論文電泳凝膠圖像應用舉例

調研還發現，文中明確所用的凝膠成像分析儀中，有GelDoc XR 2篇、AlphaImager EP、AlphaImager HP各1篇。這幾款面世超10年的機型，CCD分辨率均剛達到136萬像素標準，離268萬像素的要求尚有差距。

這種情況，Zoom是解決圖像分辨率不足的最有效辦法。將凝膠或培養皿在樣品臺居中后，啟用Zoom控制調整鏡頭焦距，讓圖像盡量充滿預覽框，再聚焦和采集圖像，圖像分辨率將提升近140萬像素，無論是提交審稿還是在線瀏覽，原圖放大也不再難堪。

參考文獻：

1. GelDoc XR and ChemiDoc XRS+ Imaging System Instruction Guide Version 6.0

2. GelDoc Go Imaging System with Image Lab Touch Software User Guide（10000125685）

3.  Proteinsimple Alpha FluorChem HD2化學發光凝膠成像系統彩頁