基于應用的多功能熒光酶標儀選型-3

 （續：激酶活性HTRF檢測的熒光酶標儀解決方案-上）

二、HTRF技術對測試儀器系統的要求

       Cisbio Bioassays公司（2019年4月并入美國PE/PerkinElmer）不生產測試儀器，而是通過對PerkinElmer、Biotek、BMG、Molecular Devices、Tecan、Thermo Scientific等主流品牌制造商的多功能熒光酶標儀實施HTRF檢測資質認證的方式，借船出海，讓HTRF技術應用一路保持著乘風破浪、行穩致遠的態勢。

       為HTRF技術應用保駕護航的，是Cisbio為HTRF專利技術建立的一套檢測標準體系。該標準對測試用儀器硬件配置、系統工作參數設置和數據處理方法等都有完整而詳盡規定。

2.1 HTRF檢測對儀器硬件條件的要求

       HTRF技術是依托TRF、FRET兩種熒光分析方法建立的，故執行HTRF測試的儀器，從光源、光路配置、檢測器及軟件系統設置，除要適應TRF、FRET檢測要求，還要符合HTRF檢測技術標準。

       HTRF抑或TRF，都基于測試信號與普通熒光、樣品背景熒光的衰減時間(fluorescence decay time)的巨大差異原理，在熒光激發和信號檢測兩個動作間引入一個50 - 150μs的檢測時間延遲，待被散射的激發光和短壽命樣品自發熒光自然消退殆盡，再測定FRET機制釋放的熒光信號。用時間門控的方法排除非特異熒光的干擾，來實現高信噪比、高靈敏度。此外，HTRF、TRF技術都用了鑭系元素離子型配合物作熒光標記，測試所用的激發、發射濾光片配置基本一致。只不過，HTRF需加一組檢測光學元件以測定第二發射熒光信號。而HTRF與FRET雖檢測原理方法一致，但具體細節則大相徑庭。

       歸納起來，滿足HTRF認證標準的多功能熒光酶標儀，硬件配置有以下特點。

2.1.1 檢測光源

       HTRF檢測光源可以采用閃爍氙燈（Xenon flash lamp）或高能激光器（TRF laser）。

       氙閃燈閃光頻率高（最大200Hz），波長分布范圍廣（240 -1200nm）。其中檢測常用的紫外（200-320nm）、可見光譜（430-680nm）兩個區間能量處于較高水平。而鑭系元素穴狀化合物激發波長為340nm。因此，氙閃燈用作HTRF檢測是經濟易行的光源來源。但缺點是能量分布均勻，特別是320 - 340nm區帶的能量輻射相對較弱。

       而波長337nm的TRF激光器，能量集中，樣品激發充分，對強、弱兩種信號的辨識度增強，檢測的靈敏度和動態范圍都有改進。此外，每次快閃式激發結束后，能量消退迅速，沒有閃爍氙燈常見的能量消退“長尾”，故激光器脈沖引入的背景持續時間短、強度弱。只需更少激發頻次，即可達到檢測積分效果。實測表明，TRF激光器激發一次采集的熒光信號足以媲美常規氙閃燈激發10次采集信號積分效果，可在36秒內完成1536孔板測定，有顯著速度優勢并保持Z'>0.8的測試質量。這是HTRF檢測系統引入TRF激發光源的價值所在。

2.1.2 傳輸光路

       HTRF檢測光路須是濾光片架構(filter-based)，通常系統配置專用一組340nm激發濾光套件(Excitation filter set)、620/665nm兩組發射濾光片組件(Emission filter set，含二色分光鏡)。VantaStar、FluoStar Omega、EnVision、SpectraMax iD5、Synergy NEO2、Infinite F Plex系統均采用此配置思路。

       MD的SpectraMax i3x、SpectraMax Paradigm多功能熒光酶標儀，因為采用的光源-光路集成式卡盒式模塊化設計，因此只需選擇HTRF專用檢測卡盒(0200-7011)，其內置符合Cisbio HTRF測試標準的氙閃燈、傳導光路設計和616nm, 665nm兩組特異性發射濾光片，可實現即插即用。

2.1.3 信號檢測器

       HTRF與FRET、BRET檢測，都需對能量的供體、受體兩個發射熒光信號進行采集測定。理論上，為避免樣品因時間不同、激發能量波動、檢測器自身工作暗電流波動產生的噪音干擾，兩組信號應該實施同步測量。為此，通常測試儀器要求是雙重濾光光路、雙PMT配置來并行測量 2 個發射波長，即同步雙發射(Simultaneous Dual Emission，SDE)測定。主流品牌多功能熒光酶標儀中，BMG VantaStar、FluoStar Omega、Polarstar Omega、PerkinElmer EnVision HTS和Agilent BioTek Synergy NEO2屬于這種情況。

       SDE不僅降低測試值%CV，同時更有利于HTS應用。實際上，HTRF技術開發過程中，正是依托SDE檢測平臺進行的。

       目前，除經典SDE同步測定方法，非同步測定方法——Two sequential measurements（TSM）也已被Cisbio HTRF標準體系采納。所謂TSM，即兩種熒光信號按（受體）發射熒光—供體發射熒光的順序分為兩次、連續循環測定方法（Sequentially measure the two emissions one after the other）。

       HTRF檢測中，Eu³⁺等鑭系元素穴狀化合物發射熒光壽命不過1000 μs，而測試儀器PMT檢測時間窗口（Window time or Integration time）長達400-600 μs，已基本覆蓋或代表了的黃金采樣窗口。在一個采樣循環時間內，顯然無法按順序依次完成供體熒光、受體熒光信號采集。故兩種信號的測定只能分步進行：第一個激發周期（cycler或flash）的600μs窗口檢測供體信號，第二個激發周期采集受體熒光信號。只要確保每個采樣周期設定參數一致，系統工作狀態基本穩定，則從兩個連續周期分別測得的兩個熒光信號，與在一個周期內同時采集的兩種熒光信號，理論上等效。Tecan Infinite F200 PRO 、MD SpectraMax iD5系統的HTRF認證測試程序中， 620 nm、665 nm兩種信號數據就是基于TSM模式得來的。

       這表明，作為TR-FRET技術中特例，HTRF檢測檢測數據，既可以用經典SDE方法測定產生，也可以是TSM非同步連續測定完成。這等于宣示：造價相對低廉的單PMT配置系統同樣可以申請HTRF檢測認證。

2.2 HTRF檢測對應用程序設置的要求

       Cisbio對MD、Tecan、PE、BioTek和BMG等品牌測試儀器的HTRF認證應用程序，會因各儀器配置、技術性能、默認運行參數設置不一，實行了個性化量程定制的HTRF檢測協議，以確保檢測數據質量符合Cisbio的信噪比、DF%、CV%、靈敏度和動態范圍等多項認證標準。資料顯示，即便是相同HTRF應用，如Europium cryptate donor/ Red acceptor readout，不同儀器HTRF測試協議中諸多參數設置互不兼容。

       我們首先看看HTRF檢測協議都有哪些核心要素。

2.2.1 檢測脈沖數（Number of flashes）

       在對單個樣品測定過程中，激發光源的一個開啟激發關閉動作、一個短暫待機和檢測器的一個啟動信號采集到停止動作，這三個內容組成的一整套測試活動可稱為一個閃光（flash）、脈沖（pulse）、讀數（read）或一個檢測循環周期（cycle）。

       每一個樣品孔通常都包括許多個重復脈沖動作。不同儀器設定的脈沖數有差別（10-200個）。

2.2.2 激發時間（Excitation Time）

       激發光源在每個脈沖中持續工作激發樣品時間，稱為激發時間。

       HTRF檢測中，閃爍氙燈用的是50μs固定時間，確保樣品充分激發。高能激光器脈沖激發能量集中而強度高，檔次激發時間可縮短至數微秒。

2.2.3 檢測延時（Integration delay/Measurement delay/Lag time）

       激發光源關閉后、檢測器啟動熒光信號采集前有一段無光電操作的空白時間，稱為時間延遲。

       通過測量時間延遲，就可以在激發光、待測樣品基質自發短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，消除其干擾，得到背景極低而信噪比極佳的特異性熒光強度測值。

2.2.4 檢測時間（Integration Time）/信號采集窗口時間(time of windows）

       是指在一個脈沖中，從檢測器啟動信號采集工作到結束信號采集這段時間長度，稱為積分時間或檢測窗口期。

       每個樣品孔要歷經10次以上的脈沖，而每個脈沖的積分時間是固定的。

       PMT光譜響應特性（同一個制造商生產同一種型號光電倍增管，光譜響應特性也不完全一樣）、量子效率（Quantum Efficiency）、暗電流變化（限制了對弱光信號的檢測的分辨能力，即靈敏度）、信號響應時間（把光脈沖轉換并輸出光電脈的時間，約10ns）等性能影響對測量結果大。積分時間需綜合信號強度、暗電流噪音、Delta F幾個指標動力學特性才能確定。最佳積分時間方案是噪聲最小化的同時Delta F 最大化。資料顯示，SpectraMax iD5系統最佳積分時間為在500 μs至1000 μs范圍內，噪聲最小化而Delta F較高。

       測試表明，隨著脈沖次數增加，Delta F 值顯示出變異性較小趨勢（CV 越好），同時背景噪音減少，檢測限提高。因此，優化每孔樣品的積分時間和脈沖數這兩個參數可提示系統檢測性能。

       每個樣品測度時間為（測試板位置機械移動、定位的時間不計入）：

        （延遲時間+積分時間）×脈沖數量 = 單孔樣品檢測時間。

2.2.5 信號增益調節（Gain）

       Gain即光電倍增管的增益。PMT通過光電陰極面接收光信號將光子能量轉換成光電子后，經過多次聚集、加速、轟擊而實現電子數目疊加倍增，在PMT陽極端輸出電流，而PMT的輸出電流大小和入射光子數成正比。

       PMT增益用末端輸出電流與前段陰極電流比值表示，可理解為電流的倍增率。通常，增加PMT陰陽兩極的工作電壓，則增益增加。

       PMT自動增益調節功能，是指儀器根據樣品信號強度，自動選擇合適的PMT工作電壓。此外，PMT允許手動增益優化設置。增益調節的作用是系統可在一定數量級別內同時穩定測定高、低信號相差7個數量級上的不同樣品。

2.2.6 Z軸高度調整（Z-position）/讀板高度（Read height）

       HTRF檢測要將高能激發光源、測試探頭都精準聚焦于樣品上，以實現有效激發和信號采集。Z軸-聚焦調整功能，能優化讀板的Z-高度，以適應不同通量、孔樣品直徑、樣品頁面高度的測試板的檢測，減少測試信號損失，并降低孔間串擾。

表1 Cisbio HTRF認證的HTRF檢測專用參數設置

       根據表1內容，我們可以作如下解讀：

       1）不同品牌多功熒光能酶標儀的檢測脈沖數、延遲時間、積分時間不同，使得單孔樣品檢測效率不同。按HTRF檢測速度從高到低將表中五款機型排序，結果是：Infinite F200 PRO ＞Synergy NEO2 ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ FluoStar Omega；

       2）依據單孔樣品信號檢測時間參數，按測試靈敏度從高到低這5款機型排序結果為：FluoStar Omega ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ Synergy NEO2 ＞ Infinite F200 PRO；

       3）為Ciobio HTRF檢測建立的標準測試protoco中，延遲時間、積分時間、脈沖次數之間存在制約、互補關系。以FluoStar Omega、Polarstar Omega為例，雖然時間延時少（60 μs），積分時間短（400 μs），但脈沖次數多（200次）。而SpectraMax iD5時間延時長（100 μs），積分時間長（600 μs），但脈沖次數少（50次）。因此，確保每個樣品的總積分效果在不同平臺間測試結果的可比性、可靠性。這正是Cisbio HTRF認證創建個性化檢測協議的魅力和意義之所在。

       相比為各品牌不同型號的多功能熒光酶標儀擬定千篇一律測試協議的指南規范，Ciobio的HTRF標準體系采用“一機一議、因機施策”的方法，顯然更科學嚴謹、更具可行性。

 (續：激酶活性HTRF檢測的熒光酶標儀解決方案-下)