分子生物學實驗樣品用量少，核酸蛋白提取的產量有限。不要說標準石英比色皿（Cuvettes）最低測試樣品體積（Min. Volume）0.5mL、半微量比色皿（Semi-Microcell）動輒0.10 - 0.25mL，即便是50 μL微量比色皿（Microcell），上樣體積也達到50 μL。對于常規10-25μL的PCR反應體系，這樣的核酸樣品耗費，顯然太過豪奢。撇開標準10mm光程最高檢測濃度上限較低不談，對低豐度樣品稀釋至50 μL后，很可能超出標準10mm光程紫外吸光度最佳測試范圍，測試準確性難以保障。因此，核酸蛋白測定體積的微量化成為分子生物實驗的時代剛需。

       縱觀國內外眾多微量紫外可見光度計產品的技術特點，不難發現，在探索和實現樣品紫外微量化測定的風塵中，依稀可見5個用自己方式追逐夢想的身影。

一、Eppendorf BioPhotometer生物分光光度計

       1998年，隨著PCR實驗日漸普及和實時熒光定量PCR商業化應用，Eppendorf將從常規綜合型紫外可見分光光度計中的核酸、蛋白及細胞測定等有關功能方法加以整合，率先推出了BioPhotometer生物分光光度計。                                              

       BioPhotometer對核酸蛋白按測定任務分門別類予以細化、模塊化，并在儀器控制面板設置專門功能鍵。譬如核酸測定工作，面板上設置了dsDNA、ssDNA、RNA、Oligo四個快捷功能按鍵。蛋白測定直接細分為Protein 280nm、Bradford、BCA、Lowry法。實現了測定任務的一鍵直達。
        不僅如此，系統已預置了每項應用程序的測試參數和條件，無需常規紫外應用軟件復雜層疊菜單操作和設置，使得測試數據規范化，減少人為設置失誤。如雙鏈DNA樣品測定，系統自動完成A260 nm以及額外的A230, A280和A340 nm共4個吸光度指標測定報告，同時自動顯示樣品濃度測定結果以及A260/280、A260/A230兩項核酸純度比值。
       BioPhotometer生物分光光度計的創造性設計，真不愧是同類儀器的開發者、實驗研究人員的“導師”。

      Eppendorf在生物樣品測定技術領域的另一個創新，是開發出測試波長范圍220 -1600nm的紫外可見通用型雙光程UVette比色皿。

       按照朗珀-比爾(Lambert-Beer)定律基本原理：同種物質樣品溶液，濃度越高，Ia值越大；相同濃度樣品，測試光程b越大，Ia值越大；壓縮測試光程，Ia值減少。

       UVette為精巧的漏斗造型設計：底部為長10mm×寬2mm×高2mm的狹長形微量樣品槽（容積50μL），中部為漏斗部（總容積500μL），上部為正常比色皿形狀（總容積1mL）。

       采用兩種光程設計，既可以沿著底部狹槽的10mm的長軸方向檢測，也可以將UVette旋轉90°使光束沿著2 mm短軸方向檢測。其優勢在于：普通濃度范圍的樣品使用10 mm光程測定；高濃度樣品，用2mm短光程檢測，通過軟件算法自動歸一化處理轉換為10mm測試值。

       實測中，約200mg臨床肥胖癥患者來源的脂肪組織提取總RNA（產量20-60μg），分別溶于30-50μL 含DEPC去離子水中制成原液。取1μL RNA原液用DEPC水按1:75比例稀釋后，移入Uvette，在Biophotometer分光光度計上進行A260測定。實時熒光定量PCR反應結果表明，UVette微量比色皿測定性能滿足qPCR實驗的總RNA樣品測定量要求。

二、日立UH5300紫外可見分光光度計

       標準光程比色皿，底面為10mm×10mm正方形，測試光束從比色皿正面距離底面8.5mm高度的中心位置垂直入射，光束中軸位置對應的樣品體積為0.85μL，樣品體積須大于此容積方可進行正常檢測。由于液面存在一定弧度的向下凹陷，為確保液面中心（最低處）位置高于測試光束，故實際測試樣品體積不少于1mL。

       要減少樣品體積，只能以測試光束在比色皿后壁的出射點為中心，X、Y、Z三個方向上同時縮減液體所占空間。

       測算表明，2mm寬×2 mm深×1 mm厚的液樣，容積為4μL。只有當測試光束形成橫切面直徑1.0mm的圓形光斑或邊長1.0mm×1.0mm正方形（對角線為1.44mm），才能實現最低1.5μL樣品完整包繞測試光束。

       世上無難事，只怕有心人。

       日立公司2013年上市的UH5300，就提供了一款痕量樣品池(trace sample cell)。該樣品池的光程僅1mm，可用于1.5 - 4μL樣品的測定。

       資料顯示，UH5300微量比色皿解決方案具有代表性：墊高微量檢測池架的位置，樣品溶液層厚度壓縮到1mm（壓縮了光程，可通過軟件算法校正為標準10mm光程的校正值）。

       考慮到加工難度和移液器加樣的可行性，1.5μL液量很可能已是這類比色皿款式樣品池容積的下限。

       該檢測池須與池架底座(holder base，用于墊高檢測池架，使池內液體的中心抬高與測試光束的中軸重合)、檢測池架 (single cell holder,比色皿架)和比色皿遮光罩(cell mask)一起使用。除非UH5300主要用于生物學微量樣品的測定，否則微量測定模塊與其他常量應用測試模塊的更換，要耗費功夫。

       此外，每個樣品測試前，樣品池都需經自來水沖洗、去離子水沖洗、甩干或風干后使用，操作之繁瑣，不言而喻。

三、AlphaSpec μL微量分光光度

       0.5-2.5μL量程移液器被常用于PCR實驗中模板、引物的精密移取操作。

或許受此啟發，原美國Alpha Innotech公司于2008年開發出了AlphaSpec μL微量紫外可見光度計（已停產）。它不用比色杯、毛細管，也無需將樣品滴加到檢測器表面。關鍵在AlphaSpec采用透射紫外的聚合物材料、結構特殊設計的AlphaUV移液吸頭。

       這種吸頭上部與吉爾森P10移液器吸頭完全一致，但接觸樣品的底部為類似USB接口的長方體扁管（內腔厚度1mm，相當于1mm光程，有效容積2.5μL）。液體控制與常規移液器操作完全一致。

       檢測光束可以垂直穿透吸頭薄壁檢測樣品。操作時，移液器裝上AlphaUV吸頭后插如特制的檢測器接口，2秒鐘測試完成后，取下移液器并更換一新吸頭，可立即進行下一個樣品測定。無須清潔測試端口樣品殘留，操作簡便、高效。因此，特別AlphaSpec適合于樣品量極其有限，希望完成測試后可以回收樣品的研究工作。

 （待續）