可能原因及解決方案

一、DNA模板

1、完整性較差

建議方法：

1）在分離DNA時，盡量減少對DNA的切斷或切刻。如有需要，可通過 凝膠電泳檢測模板DNA完整性。

2）將DNA保存于 分子級別的水 或 TE緩沖液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。

2、低純度

建議方法：

    1）使用純化試劑盒分離模板DNA時，應嚴格遵循試劑盒生產商的建議。查閱用戶手冊和疑難問題指南，改善較低的DNA質量。

2）如果采用化學或酶促DNA純化方案，應確保無PCR抑制劑殘留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。

3）使用70%乙醇再純化或沉淀和洗滌DNA，去除可能會抑制DNA聚合酶的殘留鹽分或離子（如， K+, Na+等）。

4)選擇具有 高合成能力的DNA聚合酶，這類聚合酶對土壤、血液和植物組織攜帶的常見PCR抑制劑具有較好的耐受性。

3、用量不足

建議方法：

1)檢查 DNA起始量 ，如有需要適當增加起始量。

2)選擇具有 高靈敏度 的DNA聚合酶用于擴增。

3)適當增加PCR循環數。

4、復雜的目的片段（如，高GC含量或含二級結構）

建議方法：

   1)選擇具有 高合成能力的DNA聚合酶，這類酶對DNA模板的親和力較高，更適合擴增困難靶標。

2)使用 PCR添加劑或輔助溶劑 ，促進富含GC的DNA和具有二級結構的序列變性。

3)增加 變性時間或溫度 ，從而高效解離雙鏈DNA模板。

5、長片段

建議方法：

1)確認所選DNA聚合酶的長片段擴增能力。使用專為 長片段PCR設計的DNA聚合酶。

2)選擇具有 高合成能力的DNA聚合酶，這類酶能夠在短時間內擴增長片段。

3)降低退火和延伸溫度，促進引物結合和提高酶熱穩定性。

4)根據擴增子長度，增加延伸時間

二、引物

1、設計存在問題

建議方法：

1)查看 引物設計。使用在線 引物設計工具 。

2)確保引物針對目的片段具有特異性。

3)確認引物與正確的目標DNA鏈互補。

2、引物陳舊

建議方法：

1）將引物重懸和分裝，并 妥善保存。

2）將新鮮的引物分裝，或按需購買新的引物。

3、用量不足

建議方法：

1）優化引物濃度（范圍通常為0.1–1 μM）。

2）對于長片段PCR和使用簡并引物的PCR，最小起始濃度為 0.5 μM。

 三、其它反應組分

1、DNA聚合酶不合適

建議方法：

1）使用熱啟動DNA聚合酶，防止校正DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶活性導致引物降解。熱啟動DNA聚合酶還能消除非特異性擴增，從而提高目的PCR產物的得率。

2）或者，在冰上配制PCR反應體系，或在反應混合物中最后添加DNA聚合酶。

2、DNA聚合酶用量不足

建議方法：

 1）選擇具有 高靈敏度 的DNA聚合酶用于擴增。

2）核對PCR使用的 DNA聚合酶推薦用量，并根據需要進行優化。

3)如果反應混合物含有高濃度的添加劑（如，DMSO、甲酰胺）或樣品來源抑制劑，可提高DNA聚合酶用量。

3、Mg2+ 濃度不足

建議方法：

1)優化 Mg2+ 濃度，以獲得最高的PCR得率。若存在EDTA、其它金屬螯合劑或非尋常的高濃度dNTP，則需要提高 Mg2+濃度。

2)查看DNA聚合酶對鎂鹽溶液的偏好性。例如， Pfu  DNA聚合酶與MgSO4 結合使用的效果比 MgCl2更好。

4、PCR添加劑或輔助溶劑過多

建議方法：

 1)查看PCR添加劑或輔助溶劑的 推薦濃度 。盡量使用最低濃度。

2)調整退火溫度，因為高濃度的PCR添加劑或輔助溶劑會削弱引物與目的片段的結合。

3)增加DNA聚合酶用量，或使用具有 高合成能力的DNA聚合酶。

4)考慮使用專為指定DNA聚合酶設計的特殊添加劑或輔助溶劑（如， Invitrogen? Platinum? DNA聚合酶附帶的GC增強劑）

5、反應混合物中的dUTP或經修飾的核苷酸

建議方法：

1）確保選定的DNA聚合酶能夠摻入經修飾的核苷酸。

2）優化經修飾的核苷酸與dNTP的比例，從而提高PCR擴增效率。

6、不均勻的試劑

建議方法：

 1）將試劑儲液與制備反應組分充分混合，消除保存和反應配制期間可能形成的密度梯度。

四、熱循環條件

1、變性效果不理想

建議方法：

1）優化 DNA變性 時間和溫度。變性時間短、溫度低可能無法獲得良好的雙鏈DNA模板解離效果。相反，變性時間長、溫度高可能會降低酶活性。

2、退火效果不理想

建議方法：

1）盡量使用 梯度熱循環儀 ，以1–2°C增量逐步優化退火溫度。最佳退火溫度通常比最低引物Tm低 3–5°C。

2）當使用 PCR 添加劑或輔助溶劑 時，應調整退火溫度。

3）使用指定DNA聚合酶在其最佳緩沖液中的 推薦退火溫度 。DNA聚合酶不同，則引物對的退火溫度也不同。

3、延伸效果不理想

建議方法：

1）選擇適合于擴增子長度的延伸時間。

2）在擴增長片段（如，>10 kb）時，降低延伸溫度（如，降至68°C）可保持酶活性。

3）使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在較短的延伸時間內也能實現 穩定的擴增 。

4、PCR循環數不合適

建議方法：

1）調整循環數（通常為23-35個循環），以獲得合適的PCR產物得率。如果DNA起始量低于10拷貝，則將循環數增加至40。