(前續(xù)：APC相襯技術(shù)在細(xì)胞顯微成像中運(yùn)用的技術(shù)原理及啟示——上)

三、APC相襯技術(shù)抑制細(xì)胞圖像光暈的技術(shù)原理與優(yōu)勢(shì)

       APC，是Apodized Phase Contrast的縮寫。Apodized一詞源于Apod（譯為無足或足部不發(fā)達(dá)的動(dòng)物，無腹鰭或腹鰭不發(fā)達(dá)的魚）。光學(xué)術(shù)語中，“腳”是指衍射極限成像系統(tǒng)光路中的旁瓣（side-lobes）或側(cè)環(huán)（side-rings）光信號(hào)。Apodization是一種用于移除“腳”光學(xué)過濾技術(shù)，用于除去衍射圖案邊緣的外環(huán)部分。例如用小孔光闌，將艾里斑周圍的衍射環(huán)濾除，使光斑中心部分通過小孔，以此來實(shí)現(xiàn)對(duì)光斑的“去腳化”。apodized、apodization都有切趾、變跡、衍射控制等涵義。尼康公司官方將APC命名為切趾相襯（相差）觀察法。

       APC相差觀察法中的“切趾”處理對(duì)象是衍射圖像中央暗斑相鄰的兩個(gè)條紋。就細(xì)胞相差圖像而言，是要切除圍繞在P0暗斑周圍的P1級(jí)明環(huán)。對(duì)干擾亮環(huán)切除用的是透射光中性濾光技術(shù)，其核心是專門開發(fā)的、同樣安裝與相差物鏡出瞳面的新型APC專用相位板。

       與傳統(tǒng)倒置相差顯微鏡所用經(jīng)典相位板光學(xué)結(jié)構(gòu)上的最大區(qū)別在于，APC相位板的共軛環(huán)內(nèi)外（參考《傳統(tǒng)倒置相差顯微鏡在細(xì)胞圖像采集中的運(yùn)用與技術(shù)局限性-下篇》）兩側(cè)分別增加了一大一?。ɑ疑腂環(huán)和C環(huán)）具有50%減光效應(yīng)的中性密度濾光片（Neutral Density Filter, ND）。

       從位置上看，共軛環(huán)主要接收的是直射參考光，而內(nèi)外兩個(gè)ND減光環(huán)則位于大、小尺寸圓孔衍射（分別與細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)衍射對(duì)應(yīng)）過程中的小角度衍射光的通路上。

       細(xì)胞器等小圓孔衍射中，光衍射角整體偏大，小角度衍射光占比低。而細(xì)胞團(tuán)塊等對(duì)應(yīng)的大圓孔衍射中，大角度衍射光少，小衍射角光占比高。因此，ND減光環(huán)對(duì)小角度衍射光量的削弱效能，對(duì)大圓孔衍射過程要顯著高于小圓孔衍射過程。

       ND減光環(huán)組要針對(duì)的是小角度衍射光，大角度衍射光則得到較完整地保留并可以暢通無阻，而這將對(duì)衍射條紋分布格局產(chǎn)生積極影響。

       根據(jù)前面的推論可知，小角度衍射光衰減后有兩個(gè)明顯效應(yīng)：一是圖像整體亮度的降低，二是削弱P1級(jí)明環(huán)近心側(cè)的亮度，使P1級(jí)明環(huán)的整體亮度中心外移，減輕與P0級(jí)暗斑外緣的重疊程度，為呈現(xiàn)P0暗斑的外圍輪廓?jiǎng)?chuàng)造了有利條件。相對(duì)而言，考慮到細(xì)胞樣品兩種衍射圓孔尺寸差異懸殊及對(duì)應(yīng)明暗條紋分布的差異，ND環(huán)減光技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)部線粒體、脂滴、肌動(dòng)蛋白束和細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)細(xì)節(jié)呈現(xiàn)更為有利。

       優(yōu)化波長(zhǎng)照明條件，利用切跖相差工作模式，還實(shí)現(xiàn)了如小鼠和人類胚胎和卵母細(xì)胞等厚樣品中的纖維結(jié)構(gòu)以及細(xì)顆粒構(gòu)造的直接觀察。

       當(dāng)然，從幾何光學(xué)角度看，ND環(huán)減光還屏蔽了亮度極高的竄擾高直射光，降低圖像背景亮度，有助于提高圖像對(duì)比度。對(duì)比顯示，ND減光環(huán)引入后的圖像視野高光區(qū)亮度下調(diào)十分明顯。

       在切跖相差觀察中，調(diào)整透照光波長(zhǎng)，可使細(xì)胞器圖像的對(duì)比度發(fā)生變化，有助于對(duì)人類胚胎卵周間隙顆粒狀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞體內(nèi)的纖維結(jié)構(gòu)的辨識(shí)。使用650 nm帶通濾光片調(diào)制透射光采集的胚胎圖像中，細(xì)胞內(nèi)部顆粒對(duì)比度高于用450 nm帶通濾光片調(diào)制照明下的顆粒對(duì)比度。這是因?yàn)檠苌涔獠ㄩL(zhǎng)增加，明暗條紋間距拉大，白光對(duì)暗斑的干擾降低的原因。

       倒置相差顯微鏡的APC相襯觀察法與經(jīng)典PH相襯觀察法，采用相同的聚光鏡環(huán)形光闌，但配套相差物鏡不同。經(jīng)典PH相差物鏡用的是DM或DL系列的PHL、PH1、PH2、PH3物鏡，而APC相襯法用ADM、ADL或ADH系列PHL - PH3相差物鏡，包括10x、20x、40x、60x和100x共5種放大倍率。Nikon公司的基礎(chǔ)型Eclipse TS2-FL倒置熒光/相差顯微鏡、Eclipse TS2R-FL標(biāo)準(zhǔn)型倒置顯微鏡及Eclipse Ti-FL系列研究級(jí)高級(jí)倒置熒光顯微成像系統(tǒng)均支持APC觀察法應(yīng)用。

四、APC相襯技術(shù)在細(xì)胞顯微成像中運(yùn)用的啟示

       APC相襯觀察法與Leica 的IPH外置集成相差觀察法，本質(zhì)都是在Frits Zernike經(jīng)典相襯觀察法基礎(chǔ)上的再創(chuàng)新應(yīng)用，對(duì)增進(jìn)倒置相差顯微鏡技術(shù)性能、推進(jìn)行業(yè)進(jìn)步具有重要意義。IPH技術(shù)開發(fā)成功，提高物鏡對(duì)多種觀察法的適應(yīng)性。APC則克服經(jīng)典相襯觀察模式下圖像中局部光亮過度集中造成光暈干擾，改善圖像中細(xì)胞外緣形態(tài)的觀察效果，更重要的是，無需熒光染色處理，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體、脂滴顆粒、纖維結(jié)構(gòu)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、區(qū)室細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)的直接觀察，還可用于較厚樣品的觀察。因此，為提升傳統(tǒng)相差顯微鏡應(yīng)用效能、提升細(xì)胞圖像采集質(zhì)量開辟了一條新的途徑。

       目前，業(yè)界對(duì)這一經(jīng)典相襯顯微觀察技術(shù)的改進(jìn)工作，無論是沿著細(xì)胞成像方向?qū)?xì)胞圖像形成過程從原理上做更深入研究，還是對(duì)該成像方法所暴露問題針對(duì)性解決之道的探索嘗試方面，做的還不夠。

       徠卡IPH技術(shù)，是遵循經(jīng)典技術(shù)原理，利用現(xiàn)代顯微成像系統(tǒng)的無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)光路節(jié)點(diǎn)和接口多的優(yōu)勢(shì)，調(diào)整相位板在光路中的位置而開發(fā)的。而APC同樣是在經(jīng)典相襯技術(shù)原理范疇內(nèi)，根據(jù)衍射-干涉過程各光學(xué)要素及作用規(guī)律的深入分析而實(shí)現(xiàn)了技術(shù)迭代改進(jìn)。可見，即便是已趨成熟的細(xì)胞成像技術(shù)原理、方法同樣有再認(rèn)識(shí)、二次開發(fā)的價(jià)值和必要性。

       據(jù)報(bào)道，利用X射線顯微鏡所特有的對(duì)厚樣品直接進(jìn)行無損高分辨顯微成像潛力，將經(jīng)典相襯技術(shù)與X射線相襯顯微成像結(jié)合而開發(fā)Zernikel X射線相襯顯微成像裝置，用于生物樣品的顯微成像可達(dá)到30nm的超高分辨率。而基于經(jīng)典相襯圖像的相位、振幅和像之間的函數(shù)關(guān)系，利用Cycle-GANs深度學(xué)習(xí)算法開發(fā)的虛擬相襯成像處理方法，可將普通光學(xué)明場(chǎng)顯微鏡獲取的細(xì)胞明場(chǎng)圖像轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)相襯圖像，細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)具有極佳效果。而將圖像AI算法與傳統(tǒng)顯微鏡的結(jié)合，有望消除經(jīng)典相差圖像中的光暈現(xiàn)象，提升細(xì)胞相差圖像信息對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能分析的價(jià)值。

       并非只有STED、GSD、SIM、PALM和STORM這些帶著“前沿、新興、高精尖”標(biāo)簽的技術(shù)體系才值得跟跑和關(guān)注。

       培養(yǎng)細(xì)胞觀察過程中常用的4x - 40x物鏡相差物鏡的相位環(huán)規(guī)格有PHL、PH1、PH2之分，使用不同倍率物鏡時(shí)通常需檢查和核對(duì)聚光鏡環(huán)形光闌與相差物鏡PH標(biāo)示規(guī)格的一致性，并據(jù)此調(diào)整光路中環(huán)形光闌。Olympus公司CKX53倒置相差相位鏡采用的集成相襯系統(tǒng)（integrated Phase Contrast, iPC)，是針對(duì)4x - 40x物鏡物鏡的相位環(huán)規(guī)格特點(diǎn)，而開發(fā)的通用型PH1環(huán)形光闌及相襯滑板CKX3-SLP。實(shí)現(xiàn)了在不同放大倍率物鏡間切換觀察而無需反復(fù)調(diào)整相襯光闌的簡(jiǎn)便化操作。這一應(yīng)用模塊的技術(shù)含金量并不高，但卻實(shí)實(shí)在在提升了使用體驗(yàn)，已成為進(jìn)口倒置相差顯微鏡行業(yè)的風(fēng)向標(biāo)。

       從Olympus開發(fā)的細(xì)胞3D成像反轉(zhuǎn)對(duì)比技術(shù)（Inversion Contrast，IVC)，到蔡司新型激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)用的Airyscan技術(shù)，從日本橫河（yokogawa）公司開發(fā)成功后在激光共聚焦掃描顯微鏡、高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)廣泛使用的雙轉(zhuǎn)盤共聚焦光學(xué)技術(shù)（即微透鏡增強(qiáng)型雙轉(zhuǎn)盤掃描技術(shù)，Microlens-enhanced Nipkow Disk Scanning Technology），到美國(guó)PE公司開發(fā)用于Opera Phenix高內(nèi)涵成像系統(tǒng)上可支持FRET、鈣離子成像應(yīng)用的Synchrony光學(xué)系統(tǒng)，莫不是以經(jīng)典技術(shù)方法體系為基礎(chǔ)，在痛點(diǎn)和難點(diǎn)牽引下，經(jīng)鍥而不舍努力后善作善成之杰作，實(shí)現(xiàn)技術(shù)性能的迭代和彎道超車。在技術(shù)問題上，無所謂新舊冷熱，關(guān)鍵是取決于人們對(duì)特定技術(shù)方法體系的基礎(chǔ)認(rèn)知到底有多全、多深，是否有發(fā)現(xiàn)問題的眼光、正視并解決問題的決心與恒心。

       回到透射光細(xì)胞成像話題上來，IVC細(xì)胞3D成像技術(shù)，同樣源于經(jīng)典相襯技術(shù)體系。起因是Yoshimasa Suzuki等認(rèn)為，無論是經(jīng)典相襯觀察技術(shù)，還是尼康公司開發(fā)的APC方法，不能從根本上消除圖像中的光暈。故摒棄傳統(tǒng)的光波相位-振幅調(diào)制法而另辟蹊徑，用“相位-光通量調(diào)制”方法開發(fā)出專用于厚組織樣品3D成像技術(shù)。這一技術(shù)方法的特點(diǎn)是保留了經(jīng)典相襯體系中的透射光環(huán)形光闌而去除物鏡相位板。其理論基礎(chǔ)是光的折射原理。利用透射光經(jīng)折射后光傳播路徑發(fā)生偏移的內(nèi)在規(guī)律，針對(duì)10x物鏡入瞳直徑而調(diào)整環(huán)形光闌大小，利用不同透射光傳播方向偏移程度的不同，調(diào)制物鏡入瞳光量和入瞳角度，將觀察對(duì)象的折射率、尺寸大小、樣品厚度及表面外形傾斜角度等細(xì)微差異以圖像色澤明暗的形式精確呈現(xiàn)。此觀察模式下，類器官、胚胎細(xì)胞外形和3D立體構(gòu)型被塑造得栩栩如生。而在經(jīng)典相襯技術(shù)方法中，透射光折射方向偏移這一事實(shí)，是學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界一直忽略的因素。

       實(shí)際上，即便APC相位板，技術(shù)上也并非至臻至美。不同細(xì)胞群大小尺寸不同，ND減光環(huán)的寬度設(shè)計(jì)及光透射率的優(yōu)化，透射照明光源波長(zhǎng)優(yōu)化，透射光因傳播方向偏移造成相位板上竄擾污染問題，都還值得我國(guó)業(yè)界去探求和解決（感謝許銳偉幫助提供資料）。

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