應用驅動型qPCR儀選型攻略-3

       實時熒光定量 PCR 儀的熒光檢測單元通常包括了寬譜基礎光源、入射激發光模塊、發射熒光模塊和熒光信號采集數碼相機等基本組件。針對特定熒光基團的光吸收、熒光發射光譜特征，將最適的激發光濾鏡模塊、發射光濾鏡模塊藕聯，組成了波長范圍固定的光學通道用于采集熒光信號。每一色熒光對應一個專用通道，如FAM/SYBR GREEN青-綠色光通道、VIC/HEX/TET綠-黃綠通道等，可確保檢測靈敏度與準確性。

       曾經，人們把熒光定量PRC儀內部這樣一個光學通道稱為一“色”，并按通道配置數量在儀器名稱中加以區分。如1995年推出的ABI PRISM 7700 Sequence Detection System實時熒光定量PCR儀，配有FAM, JOE, HEX及TET四個檢測通道，稱為4色定量PCR儀。DNA Engine Opticon 2只配置了用于SYBR Green I /FAM、HEX/TET/ VIC/TAMRA兩種波長熒的光檢測通道，故名Two-Color Real-Time PCR Detection System。如今，新型qPCR儀諸如QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Pro，CFX96-touch、CFX Opus 96、LightCycler 480 II等，熒光檢測通道數量達到6個，卻不見人用6色實時定量PCR儀來冠名。

       是什么削弱了熒光定量PCR系統檢測通道的數量與可檢測熒光色數之間的聯系？6通道qPCR儀能進行6色熒光的檢測嗎？

一、ROX參比熒光校正占用了屈指可數的熒光檢測通道資源

       對于qPCR定量實驗中引入ROX參比熒光對報告基團熒光信號及非PCR反應造成的熒光信號波動均一化（Normalization）的必要性，業內外歷來是仁智互見、各執一詞。

1.1 qPCR實驗ROX校正有用論

       支持加入ROX參比熒光校正者認為，在實時熒光定量PCR實驗中應用ROX熒光染料的意義，至少有4個方面：

       1.1.1 校準各孔反應體系構建時PCR組份移液加樣操作誤差，消除反應濃度或體積變化引起的孔間熒光信號強度波動；

       1.1.2 將同一次運行中全部報告熒光基團信號的強度均一化，校正不同位置反應孔釋放的熒光信號因與CCD間光程不同引起的強度誤差；

       1.1.3 消除儀器檢測器本身噪音引起的熒光信號波動，同時為多重實時熒光定量PCR分析提供穩定基線；

       1.1.4 ROX染料不干擾實時熒光定量PCR反應擴增效率和特異性、報告熒光基團的信號檢測。

       TaqMan Universal PCR Master Mix（TaqMan 通用實時熒光定量PCR預混試劑）、TaqMan Fast Advanced 預混液中都含有ROX染料。讀取ROX校正熒光信號要單獨占用一個檢測通道，則待測試樣品檢測探針不能采用與ROX具有相同光譜特征的報告熒光染料，結果必然是樣品可用的熒光信號采集通道減少一個。這在multiplex多色熒光定量實驗設計中尤其重要。使用4通道的StepOnePlus熒光定量PCR儀最多能在單管內進行同時擴增3個靶序列。若要完成4重PCR定量分析（quadruplex qPCR assays），就需采用像7500、7500Fast、QuantiStudio 5、QuantiStudio 6/7Pro、QuantiStudio 6/7 Flex 和CFX 96 Touch、CFX Opus 96等配置更多色熒光通道的平臺上進行。

1.2 qPCR實驗ROX校正無用論

       也該觀點的認為熒光定量PCR實驗中引入ROX參比熒光校正毫無意義。

       理由主要是：

       1.2.1 定量實驗的反應體系包括了通用PCR擴增預混試劑、正反向引物對、探針、樣本或標準模板在內多種組份。對組份的加樣操作誤差是客觀存在的，幾乎是每一輪組份的加樣移液，本質上都是在引入并不斷積累誤差。

       以PCR實驗常用的微量移液器為例，視單次移液量和所用的移液器規格不同，每次操作都可能存在1-2.5%甚至更高的系統誤差、0.3-1.5%的隨機誤差。

表1 常用單道可調量程微量移液器加樣誤差表

（數據來源于eppendorf官網）

       事實上，反應組份越復雜、手工操作次數越多，系統誤差、隨機誤差和人為操作精度誤差綜合后必造成各反應孔最終擴增體系的體積、組份濃度的細微區別。通過改進操作儀器精度、操作熟練程度、提高PCR反應體系構建的自動化程度，誤差固然可以縮小。但移液加樣誤差單靠PCR預混試劑中ROX信號強度歸一化是無法有效消除的。大量實驗也證明，即便依然存在誤差，只要控制在一定范圍內，不會對實驗結果產生根本性影響。因此，添加ROX組份可視作一種無用功。

       1.2.2 不同品牌型號實時熒光定量PCR儀的光學檢測單元結構設計存在區別，對采用ROX信號校正PCR反應板各孔熒光信號光程誤差的必要性是完全不同的。

       伯樂CFX 96-touch、CFX Opus 實時熒光定量PCR儀的光學檢測系統為光梭式設計（optics shuttle）。光梭移動呈現“弓”字形軌跡，從A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12走完整板全部96個反應孔。

        當采集某一孔的某種熒光信號時，光梭中的步進馬達驅動特定光學通道移到被檢測PCR孔正上方精確對焦，再啟動激發、熒光信號采集。不同檢測通道、不同反應孔是等距掃描和信號采集，不存在反應孔間熒光光程和誤差問題，故無需引入ROX校正。

       既然無需ROX參比熒光，則與之對應的560-590nm波長檢測通道就可用作Texas Red/CAL Fluor Red 610這類報告熒光探針檢測信號采集。在伯樂CFX Opus 96 real time PCR Detection system可選擇FAB、HEX/VIC、Texsa Red、CY5和CY5.5組合完成分別用5種顏色標記探針實施5個靶基因的同步檢測。

       對引入ROX參比信號校正存在的截然相反意見且各自所指導的qPCR實驗已踐行多年，故qPCR儀運行編程界面都有ROX設置選項，便于實驗者基于自身經驗和試劑使用說明自由決定。

       因此，不同品牌型號qPCR儀，如Applied Biosystems 7500 VS  Stratagene_Mx3500P，雖均為5個檢測通道，但在實際使用中，因不同實驗、不同探針和配套試劑不同，在Multiplex多色定量分析中可同時檢測的靶標種數可能不同。

        簡單地將系統檢測通道數量與Multiplex反應中熒光色數掛鉤劃等號不僅沒有意義，反而有犯錯的風險。

二、FRET探針檢測引入使qPCR儀多色熒光檢測通道“灌水”

       羅氏LightCycle系列 FRET探針，又稱雙雜交探針（HybProbe Probes），由兩條分別能與靶片段上下游兩個相距1-5bp的特異結合位點互補的探針組成。上游探針3`端標記的是熒光素（Fluorescein），作為下游探針熒光能量的供體(Donor)；下游探針5`端標記受體熒光基團，如LightCycle Red 610、LightCycle Red 640和Cy5等，作為FRET效應的能量傳導受體(Acceptor)。

       在PCR循環的復性階段，兩條探針同時結合到靶片段上。上游探針末端供體基團被入射光激發產生熒光。此時因供、受體基團緊緊相鄰而發生FRET反應，受體基團吸收供體發出的綠色熒光能量后以波長更長的黃色、橙色或紅色熒光釋放出能量。系統檢測器通過優化的濾光片配置，濾除上游供體基團發射的熒光，只采集下游受體釋放的熒光信號用作分析。

       以LightCycler 480 II的Mono Color HybProbe 檢測模式為例。采用HybProbe Fluorescein (Donor) +LightCycler Red 640 (Acceptor)探針組。采用498nm初始激發光源激發供體，釋放510 nm波長的熒光，經FERT機制能量被受體吸收后，Red 640煥發640 nm波長的熒光。而CCD前端配的正是618-660nm帶寬Emission Filter而非常規FAM/SYBRGreen I檢測通道用的510 nm濾光片，可以有效濾除供體殘余熒光信號。常規FAM/SYBRGreen I專用熒光通道無法檢測HybProbe探針FRET熒光，而FRET檢測通道只能為HybProbe探針提供專享服務。

       若要進行FAM和Red 640組合的單管多重實時定量分析，qPCR儀必須同時具備常規FAM/SYBRGreenI檢測通道和Fluorescein-LightCycler Red 640專用通道。兩種檢測通道的前端入射激發光模塊相同，但后端發射熒光濾光模塊不同。本質上，FRET檢查波長與常規TaqMan檢測波長是重疊的。如Red 640專用通道檢測波長的范圍(618-660nm)就與常規TaqMan探針ROX、Texas-Red所用的紅色熒光波長（623±14nm）基本重疊。兩種探針競爭檢測波長資源，則必然造成因熒光信號竄擾（Cross-talk）而干擾檢測結果的問題。

        魚（TaqMan等水解型探針）和熊掌（FRET探針）只能二選一：每增加一個FRET專用通道，則要有一個TaqMan信號通道被替換掉。

三、實時熒光定量PCR儀檢測通道與multiplex多色檢測能力的區別與聯系

       20多年前，具有超凡遠見卓識的實時熒光定量PCR儀先驅開創了4熒光檢測通道的配置架構，使采用FAM+VIC雙色熒光探針進行單核苷酸多態性檢測（SNP Assays）和在單管內多個基因同步檢測分析（multiplex）方法成為現實。

       系統配置的光學通道數量越多，多色熒光檢測應用越靈活。

        但檢測通道數與可同步檢測熒光信號種數之間既聯系又有區別。原因就在于qPCR儀廠商、實驗者對ROX熒光參比校正應用、熒光共振能量轉移（FRET）探針檢測功能要求的不同。

表2 實時熒光定量PCR儀熒光檢測通道與多重PCR反應對比表

       在不引入ROX熒光參比校準情況下，CFX96-touch、CFX Opus 96系統名義上是6個熒光檢測通道，但實際至多可進行5色多重定量檢測，與配置5個熒光通道的7500 Fast系統最大檢測范圍相當；而同屬3通道配置經濟型實時熒光定量PCR儀，CFX Connet只能進行Duplex，但QuantiStudio 1最多可進行triplex定量分析。

       盡管LightCycler 480 II具有6個檢測通道，但在多重定量模式下，由于FRET探針的上游供體熒光基團Flourescin需占用FAM標記探針激發通道，同時Flourescin發射光譜（515-530nm）與VIC/HEX/CAL Fluor Gold 540/Cal Fluor Orange 560/TET等第二個常用熒光通道激發光譜（515-535 nm）重疊，勢必會削弱FRET探針中Donor激發能量，因而須關閉VIC/HEX熒光通道。可見，因為熒光激發通道、檢測通道工作光譜間的嚴重重疊干擾（“內卷”？），LightCycler 480系列最多只能進行4重定量檢測（4 Colors Hydrolysis Probes Assay Detection Format）（LightCycler Cyan 500：Ex 440nm/Em 488nm；FAM：Ex 498nm/Em 580nm；LightCycler Red 610：Ex 533nm/Em 610nm；Cy 5/Cy 5.5：Ex 618nm/Em 660nm）。若完全基于FRET探針實施multiplex實驗，最多能執行三重定量反應（Fluorescein-LightCycler Red 610, Fluorescein-LightCycler Red 640, Fluorescein-Cy 5/Cy 5.5）。

（圖片來源https://lifescience.roche.com/en_cn/articles/lightcycler-480-detection-formats.html）

       可見，曾經流行的將檢測通道數與多重定量PCR熒光色數直接“藕聯”形成的“N色實時熒光定量PCR儀”概念已是名不副實、漏洞百出，甚至有混淆誤導視聽之嫌。目前，實時熒光定量PCR儀檢測適用范圍，已不再沿用可檢測幾色熒光的說法，而是用標注系統可支持的報告熒光基團的列表的方式取代。

       討論到這，我們似乎可以回答本文開頭提出的問題了，實時熒光定量PCR儀能用于6色熒光檢測嗎？定性分析是可以的，若不引入ROX熒光校正設計的話，用于6-target的多重定量檢測也無妨，但如采用的是賽默飛原裝Taqman預混試劑和探針組合，那只能實現5色定量分析。

參考文獻

ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)

實時熒光定量 PCR 手冊

The LightCycler 480 Real-Time PCR System Brochure(2014)

LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5

CFX Opus Real-Time System（Bulletin 7279）