1.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在總 RNA 的提取過(guò)程中，注意避免 mRNA 斷裂。
2.為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。
3.內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶 RNA 的定量。常用的內(nèi)參有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免 RNA 定量誤差、加樣誤差以及各 PCR 反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4.PCR 不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo) DNA 起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
5.防止 DNA 的污染：采用 DNA 酶處理 RNA 樣品，在可能的情況下，將 PCR 引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA 的共線性。
6.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于 180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。
7.塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
8.有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2 室溫 10min，然后用 0.1% DEPC 水沖洗，晾干。
9.配制的溶液應(yīng)盡可能的用 0.1% DEPC，在 37℃處理 12hr 以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC 處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。
10.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換，盡量避免其他人員干擾。
11.設(shè)置 RNA 操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。
12.DEPC 是蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑,它和 RNA 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。具強(qiáng)揮發(fā)性，致癌物，因而使用時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。
13.RT試劑盒從冰箱拿出，應(yīng)該充分解凍，瞬離后，混勻，放于冰上，可在冰上加樣。試劑可以用數(shù)字貼紙編號(hào)，避免漏加、錯(cuò)加試劑。
14.取用不同的試劑時(shí)，必須更換槍頭，樣本之間要避免交叉污染。
15.逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，PCR儀可以先預(yù)熱。
16.反應(yīng)體系配好之后，應(yīng)充分混勻，瞬離，并且彈去管內(nèi)的氣泡。
17.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)預(yù)防RNA酶污染，使用無(wú)酶槍頭以及EP管，同時(shí)臺(tái)面可以使用固相RNA酶去除劑清潔。
18.PCR時(shí)，管壁盡量避免寫(xiě)字。
19.管蓋一定要蓋嚴(yán)。
20.10μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系建議加入不超過(guò)500ng的RNA。
21.如果目的基因表達(dá)量非常低,最多加入1μg Total RNA,否則加入RNA量過(guò)高,可能會(huì)超出后續(xù)PCR的線性范圍。
22.反應(yīng)體積可根據(jù)需要等比例放大。
23.試劑盡量不要反復(fù)凍融。
24.每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔,所有成分加完后，離心去除氣泡。
25.可將所有共同物質(zhì)加入同一管中，混勻后分散入其他管中。