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業內快訊

法醫全基因組擴增

時間:2021-02-08 來源: 瀏覽量:1540

       法醫研究通常需要少量或痕量樣品。來自此類樣品的DNA可能是限制性的,使其分析困難。全基因組擴增可以通過小樣本獲得更高的產量來解決這個問題。

法醫全基因組擴增

       全基因組測序(WGA)

       開發這種方法是為了在DNA樣品有限的情況下增加信號。有兩種主要技術可擴增整個基因組:基于PCR的方法和多重置換擴增。

       法醫全基因組測序方法

       引物延伸預擴增PCR(PEP-PCR)

       基于PCR的DNA擴增方法包括簡并寡核苷酸PCR(DOP-PCR)和引物延伸預擴增(PEP)PCR。PEP使用隨機引物,而DOP-PCR使用半簡并寡核苷酸。在PEP PCR方法中,Taq聚合酶可產生高達400 kb的DNA序列,并與序列中的錯誤相關。

       dcDOP-PCR(簡并寡核苷酸引發的聚合酶鏈反應)

       此方法進行了一些特定的更改,包括并入10N簡并引物,更高質量的Taq聚合酶和增加的PCR非特異性循環。PCR后擴增步驟也增加了。

       改進的PEP-PCR(I-PEP)

       在此方法中,根據法醫需要對PEP-PCR進行了修改。同樣,在PEP-PCR中,增加的PCR循環數會導致Taq聚合酶效率降低和隨機變異數增加。在這種情況下,引物濃度也加倍,以提高其效率。

       巢式PCR

       進行巢式PCR擴增燒焦的樣品和少量血液。但是,在使用此方法時已觀察到技術困難。

       多位移放大(MDA)

       在這種方法中,隨機六聚體結合到變性的DNA。然后使用Phi 29聚合酶合成DNA。這種聚合酶不易解離,并能產生高達100 kb的DNA鏈。該聚合酶還可以解析二級結構,包括發夾環。該方法在法醫科學中被廣泛用于擴增小的DNA樣品,因為即使樣品被損壞或具有隨機變化,它也能提供良好的結果。在混合DNA樣品的情況下,MDA還可以提供良好的結果。

       全基因組擴增中的序列偏倚

       盡管PCR被用于擴增整個基因組,但是發現該方法不覆蓋整個基因組,并且當某些序列被過度代表時,由于引物優先結合到特定區域,因此該方法也具有擴增偏差。Phi聚合酶可以結合而不會產生序列偏倚,并在整個基因組中提供均勻的擴增。

       法醫分析過程中擴增片段性DNA或受損DNA

       在法醫分析過程中,經常會發現DNA樣本被打碎或損壞。根據環境條件(例如紫外線輻射,pH和樣品制備),損壞程度可能會有所不同。DNA損壞的最常見原因是化學或酶誘導的片段化。為了解決這個問題,可以使用諸如REPLI-g受損DNA技術之類的技術,該技術可以均勻地擴增整個基因組中片段化或受損的DNA樣本。它包括兩個步驟:在第一步中,準備受損的DNA進行擴增,然后在第二步中進行擴增。

       線粒體DNA的全基因組擴增

       盡管核DNA只有兩個拷貝,但細胞中卻有成千上萬個mtDNA拷貝。在一些法醫案例中,DNA樣本陳舊,損壞,受限和降解。大多數核DNA擴增方法要求DNA處于良好狀態且數量足夠。

       在不滿足這些條件的情況下,線粒體DNA的全基因組測序是一種可能的選擇。在識別失蹤人員或災難受害者的情況下,此方法尤其重要。

       全基因組擴增可為法醫學提供重要信息??梢愿鶕悠分蠨NA的狀態使用特定類型的WGA方法。可以使用I-PEP擴增單源DNA,而MDA可以用于混合DNA樣品。