（前續：低氧細胞實驗中三氣培養箱氮氣使用有效管理問題的解決方案——中 ）

三、低氧細胞培養實驗中三氣培養箱經濟平穩運行的解決方案

       三氣培養箱本為O₂治理而生，而為此付出代價最大的卻是N2，還捎帶上了CO₂。兩種氣體各自消耗量還因O₂濃度設定值而異。如三氣培養為間歇性運行，在O₂含量5%設置條件下，每次儀器重啟初始化進程所消耗的CO₂氣體流量約為同等工作容積CO₂培養箱所消耗量的10.5倍。而低氧運行維持期間，因這兩種氣體的消耗速度相差懸殊而氣瓶更換頻次不統一且隨O₂含量控制要求而變化。對設備管理者而言，多人共享三氣培養箱的情況下，要判斷N₂鋼瓶中余量液氮是否能有效應對下一步低氧實驗要求，需提前儲備多少氣瓶方可高枕無憂，這顯然極為困難。而實驗者則需對兩種氣體，特別是N₂的“高消費”開支做足思想準備。

       既要確保低氧細胞實驗運行中N₂穩定供應，又要有效降低實驗中N₂消耗，這是眾多細胞培養實驗者必須要面臨的問題。而三氣培養箱國外制造商為低氧實驗的可靠實施，提供了多種類型與N₂管控有關的工作附件選項，的確具有重要實用價值。

3.1 氣瓶自動切換器

       氣瓶自動切換器（Gas tank changer）是一種能夠為氣瓶無縫切換供氣而開發的簡便裝置。其功能設計類似于三通閥：有2個輸入端口和一個輸出端口。兩個輸入端口分別連接2個同種氣體的氣瓶（CO?、N?或 O?），可實時監控供氣瓶的氣壓。輸出端口則可與一個或多個培養箱連接。

       當第一個氣瓶中的氣體耗盡時，它將自動切換到第二個備用氣瓶供氣。當備用氣瓶的氣體也將耗盡時，裝置會發出聲光報警提醒用戶更換氣瓶。三氣培養箱配置氣瓶自動切換器后，實驗者無需在氣瓶處于低壓運行期間時刻緊盯氣壓表和并隨時準備更換氣瓶，即避免有效氣源的浪費，更有利于實現N₂供氣管理的長治久安。

       氣瓶自動切換器分為外置（External gas guard）和內置（Built-In Gas Guard）兩種。

       內置自動切換器與主機電源和控制系統連接，為出廠預裝組件，需在訂購三氣培養箱時定制。

       外置自動切換器則可由專業人員在用戶現場安裝，不僅功能強悍，且布署十分靈活。裝置同時連接一主一副兩個氣瓶，并有指示燈指示值班氣瓶。當主氣瓶中氣體用盡，裝置將自動啟用備用氣瓶供氣。切換器和主副氣瓶可以遠離培養箱的位置布置，譬如安裝在細胞間外，通過專用氣路為一個或多個不同品牌、不同型號的三氣培養箱同時供氣。外置自動氣瓶切換器既可用培養箱原廠選件，也可以使用第三方產品，升級維護方便。

       當然，無論是內置、外置氣瓶自動切換器，都是為了確保箱體供氣的穩定性，并不能解決氣體消耗量大的問題。而要切實降低三氣培養箱低氧實驗運行中的N₂消耗開支，還得靠箱體配套的分割式氣密型內門裝置。

3.2 分體式內門

       既要確保低氧細胞實驗運行中N2穩定供應，又要有效降低實驗中N2消耗，這是眾多細胞培養實驗者流量是指流體在單位時間內通過某一橫斷面的容積（或重量），可用L/min標示。流速是流體體通過截面積的速度。流體在一定時間內通過特定截斷面的體積與流體的速度和截斷面面積成正比。

       細胞培養箱若采用傳統一體式單一內門，則每次存取樣品開啟內門后，整個機箱內部全部暴露于實驗室空氣中。箱體內外氣體溫度和濃度差異懸殊，箱內高溫氣團迅速向外擴散、向上蒸騰逃逸。溫度較低的空氣通過對流迅速流入，由下而上填充到箱內的自由空間，完成對箱內工作氣體的置換。機箱正面開孔尺寸大，相當于發生氣流對流的截斷面面積大，熱氣團向外擴散自然更快，損耗工作氣體容積越大。以普和希品牌三氣培養箱為例，MCO-50M箱內正面截面的面積約1420cm2，而MCO-170M內部截面面積約3250cm2，是前者之2.3倍。如限制箱內外冷熱氣體對流通道截面面積，則可減少氣體對流的損耗。因此，人們在選擇三氣培養箱時，往往傾向于選擇Prescyto MG-71M、MCO-50M這類工作容積較小的機型。而對于多人共享培養箱服務平臺，小容量培養箱內部工作空間有限。多個實驗項目的不同實驗樣品混雜，在操作中容易發生交叉污染。

       分體式內門（Multiple-split inner door, or inner door with Multiple-segments），又稱分割式氣密性內門（Gas Tight Screen Door），是替代傳統一體式玻璃內門的密封裝置。每扇小門對應于培養箱一個隔層空間，各小門獨立開合，互不干擾。存取樣品時，只需開啟其所在隔層對應小門，而其它隔層的小門依然處于密閉狀態。因此，不會因少量樣品存取操作而將箱內所有空間樣品暴露，箱內氣體外泄發生被嚴格限制在局部范圍，有利于保持細胞培養環境穩定，降低了N₂、CO₂、O₂和水蒸氣濃度大幅波動和氣體泄漏。理論上，內門數量多，則樣品操作中箱內培養氣體環境波動小。

       分體式內門又分為一層一門和一層左右兩門兩款。eppendorf CellXpert C170i三氣培養箱有單一內門型、4分內門型和8分內門型三種機型可選。8分內門是在4分內門結構基礎上，將每個小門進一步劃分為左右兩扇小門而來，密閉防護效果比四分內門更優。再如Thermo HERAcell VIOS 160i三氣培養箱，內部工作空間分為三個隔層，有單一內門基礎款和配置3分內門多人共享版。而蜂巢式HERAcell VIOS 160i三氣培養箱雖然也是三個隔層，但標配6分式氣密內門，將箱內空間隔斷成6個獨立培養小室，可供6個實驗者可自獨享一個小室。這樣還使不同樣品交叉污染風險降低，方便共享管理。

       多屏分割式內門可以在訂購三氣培養箱時作為O₂控制系統組件之一定制和工廠安裝，也可以在單一內門使用中升級安裝。

       分體式內門裝置降低的是開門操作工作氣體的損耗。但因每日經箱體通氣口泄漏流失的氣體體積遠大于箱門啟閉次數受控條件下所致損耗。因此，如要實現低氧培養實驗中N₂供氣無憂管理，還得仰仗氮氣發生器幫忙。

3.3 氮氣發生器

       當低氧培養箱內部容積高達170L以上，或培養過程中需頻繁開門操作樣品，甚者實驗室有2臺三氣培養箱在工作，則N₂的消耗將成為一項巨大管理支出。

       此外，對于儀器公共服務平臺，因不同O₂濃度控制條件下的低氧實驗對CO₂、N₂消耗速度不同，傳統以儀器使用時長為依據的計費服務管理方法就不合時宜。而引入氮氣發生器，可將N2消耗量差異的矛盾就轉變為氮氣發生器工作時長問題，對平臺和實驗者雙方而言，都具有重大經濟價值。

       LC-MS等諸多分析儀器運行通常需要耗費大量分析級高純度氮氣。用實驗室氮氣發生器現場制氮而非氮氣鋼瓶為LC-MS分析實驗供氣，是全球多數分析儀器平臺的通行做法。

       氮氣發生器將室內空氣經多級過濾去除氣體中的灰塵顆粒和水分后，用空氣壓縮機將空氣泵入中空纖維膜濾除氧氣，即源源不斷產出99.99 - 99.999%純度的高純度氮氣。

      發生器外形小巧，一鍵式操作啟動制氮。工作人員無需反復移動鋼瓶，無需負擔傳統N₂氣瓶運輸和租賃成本，就解決了氣體穩定供應的問題。

       據已有測算數據，170L的三氣培養箱在5% O₂條件下連續運行期間N2日消耗量約351L，而完成初始化所需輸入的N₂體積為400L。如要在20分鐘完成開機初始化過程，則此間N₂輸入流量須達到20.0 L/min。而穩定運行期間所需的N₂流量僅0.25L/min。低氧維持與開機初始化進程所需輸入流量相差數十倍之多。
       無論國產進口氮氣發生器，在產氣純度達到99.5%的工業N₂標準或99.99%《醫用氣體工程技術規范》中規定N₂純度標準情況下，氮氣發生器的產氣流量與三氣培養箱開機初始化最大N₂輸入流量的匹配應作為選型的主要參考指標。

表4 三氣培養箱配套氮氣發生器技術規格實例

       表4的信息表明，日本TAITEC 公司所提供的N₂ GENESIS 200 + GST-0205M組合套裝，在N₂純度99.5%時最大輸出流量為3L/min，用于維持50 - 170L培養箱內環境維持5% O₂低氧水平是可行的。據測算，53L容積箱體在5% O₂設定條件下開機初始化進程需N₂體積約130L，若要在30分鐘類完成則氮氣發生器有效氣體輸出流量至少應達到4.4L/min。但這套氮氣發生器組合方案，視乎勉為其難。
       反觀日本PHCBi 公司的HF30氮氣發生器，其99.5%純度N₂輸出流速高達32L/min，完成MCO-170M三氣培養箱開機初始化所需400L氣體制備，耗時僅12.5分鐘，執行效率相當可觀。

       可見，50L容積三氣培養箱配套的氮氣發生器，99.5%純度N₂輸出流量應》5L/min。170L容積箱體完成5% O₂濃度條件的初始化所需N₂輸出流量應》14.1L/min，完成1% O₂條件初始化則要求N₂輸出流量》53.6L/min，則32L/min的輸出流量都顯得捉襟見肘。。
       通常，氮氣發生器系統的售價隨產氣流速增大而升高。在預算有限條件下，有效控制氮氣發生器系統造價和提升產氣流量兩種需求之間是矛盾的。而采用氮氣發生器配置壓縮氣瓶的方法，可一定程度上實現氮氣發生器流量成本控制與高峰期大流量N₂輸出需求兩個矛盾的平衡。將5-30L/min中小流量氮氣發生器+10-20L壓縮氣瓶組合后用于為三氣培養箱供氣，是較為理想的解決方案。

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