基于應(yīng)用的多功能熒光酶標(biāo)儀選型-2

       熒光素酶報(bào)告基因檢測是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）活性的一種基因表達(dá)調(diào)控指示系統(tǒng)。它利用熒光素酶與底物發(fā)生化學(xué)中會產(chǎn)生發(fā)光的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（如啟動子基因片段、靶基因3’UTR等）克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。經(jīng)適當(dāng)實(shí)驗(yàn)刺激或處理后，測定熒光素酶-熒光素反應(yīng)發(fā)光的強(qiáng)弱（代表熒光素酶活性的高低），來判斷實(shí)驗(yàn)刺激/處理對基因表達(dá)調(diào)控元件的影響。

       1996年，Promega公司在單一熒光素酶報(bào)告基因的基礎(chǔ)上引入“內(nèi)參對照”——海腎熒光素酶（Renilla Luciferase）報(bào)告基因，推出了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System，DLR）。

       DLR檢測系統(tǒng)既可以是將分別帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒、含靶基因調(diào)控元件片段的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可以是將各自帶啟動子的兩種熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建到同一個質(zhì)粒上轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再測定兩種熒光素酶活性。將熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的活性相對于內(nèi)參——海腎熒光素酶基因表達(dá)的活性做歸一化處理，以消除因細(xì)胞活性、轉(zhuǎn)染效率差異、移液體積、細(xì)胞裂解效率和檢測效率等其他因素造成的實(shí)驗(yàn)變異，提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

       DLR檢測系統(tǒng)具有靈敏度高、動態(tài)范圍廣的優(yōu)勢，被廣泛用于基因轉(zhuǎn)錄因子與啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、非編碼RNA靶向互作、啟動子結(jié)構(gòu)分析、信號通路分析等研究領(lǐng)域。

       DLR檢測中需按特定操作流程和測度時(shí)間要求，依次檢測兩種不同的熒光素酶與各自底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)反應(yīng)釋放的化學(xué)發(fā)光信號。為確保測試性能，Promega公司創(chuàng)建了一整套DLR測試標(biāo)準(zhǔn)體系，并開發(fā)出GloMax20/20、GloMax 96、GloMax Multi、GloMax Navigator、GloMax Explorer和GloMax Discover等一系列配套發(fā)光檢測儀。

       以“Dual-Luciferase Reporter Assay[Text Word] ”為條件檢索PubMed期刊論文數(shù)據(jù)庫，查到的文獻(xiàn)記錄達(dá)36793條之多。然而，這數(shù)萬余篇實(shí)驗(yàn)論文中，DLR測試用GloMax系列機(jī)型的占比不到1/4，超過3/4的DLR分析實(shí)驗(yàn)是在MD、BioTek、Tecan、BMG等主流品牌的多功能酶標(biāo)儀上完成。

       這種墻內(nèi)開花墻外香現(xiàn)象的出現(xiàn)，既彰顯DLR分析技術(shù)應(yīng)用之盛，也說明DLR標(biāo)準(zhǔn)體系已被眾多品牌多功能酶標(biāo)儀系統(tǒng)采納和引進(jìn)，從而進(jìn)一步促進(jìn)了DLR檢測推廣。

       由此，我們來討論3個問題：DLR有何特殊檢測流程，DLR對測試儀器有何特殊要求，有哪些經(jīng)濟(jì)型多功能熒光酶標(biāo)儀可作為DLR的解決方案？

一、 DLR檢測標(biāo)準(zhǔn)流程的特殊性

       螢火蟲熒光素酶在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后無需翻譯后加工即具有酶活性，在氧氣、ATP和鎂離子協(xié)同下，催化甲蟲螢光素發(fā)生氧化反應(yīng)。此過程中，部分能量以“閃光”型黃綠色（波長550-570nm）光信號的形式釋放，在底物和酶混合后會迅速衰減。通過在試劑中添加含輔酶A (Coenzyme A, CoA)，則反應(yīng)的發(fā)光由閃光轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定可持續(xù)的輝光信號，且強(qiáng)度高，便于手工操作檢測。海腎熒光素酶則在氧氣存在時(shí)催化腔腸素發(fā)生氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的藍(lán)光信號。

       故標(biāo)準(zhǔn)DLR檢測流程中，發(fā)光檢測儀讀數(shù)步驟程序設(shè)置為進(jìn)樣后2秒開始采集光信號（For the standard DLR? Assay, we recommend programming luminometers to provide a 2-second pre-read delay, followed by a 10-second measurement period.）。

       由于這兩種熒光素酶催化反應(yīng)中的發(fā)光光譜分布寬泛，可見光譜區(qū)段存在重疊。故promega的DLR檢測采用的是4步操作流程：

       不帶自動進(jìn)樣器配置的GloMax 20/20系統(tǒng)操作程序界面顯示，發(fā)光測讀步驟工作模式是1秒鐘一次，共采集10次發(fā)光信號，每次PMT采集持續(xù)時(shí)間為1秒。

       配置有1或2個自動進(jìn)樣器時(shí)，系統(tǒng)控制程序界面顯示，每個進(jìn)樣操作完成后有2秒時(shí)間延遲，然后開始測讀發(fā)光信號。信號測度分為2個步驟，每個步驟都是間隔時(shí)間1秒共進(jìn)行10次測讀，單次信號測讀時(shí)間1秒。

       為高通量DLR檢測開發(fā)的發(fā)光酶標(biāo)儀GloMax Navigator、多功能熒光酶標(biāo)儀GloMax Explorer的系統(tǒng)的內(nèi)置控制程序中，整合有Dual-Luciferase Reporter Assay System操作流程，可以直接調(diào)用。

       DLR檢測標(biāo)準(zhǔn)程序不僅適用于Promega自創(chuàng)發(fā)光酶標(biāo)儀、多功能熒光酶標(biāo)儀。作為獨(dú)立功能模塊，還通過認(rèn)證合作，嵌入到多個品牌的熒光酶標(biāo)儀系統(tǒng)控制軟件中。

       借助于儀器預(yù)置的DLR標(biāo)準(zhǔn)化程序，系統(tǒng)可在“開始”指令后自動進(jìn)行加樣并依次讀取螢火蟲和海腎螢光素酶活性數(shù)值，避免手動記錄測量值而暫停檢測操作。軟件還提供歸一化的螢光素酶值計(jì)算功能，并可對組內(nèi)測定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

       采用GloMax 20/20發(fā)光檢測儀純手動操作，完成每管樣品的檢測耗時(shí)約為30秒。期間因需手動記錄螢火蟲熒光素酶活性檢測數(shù)據(jù)，勢必造成步驟3、4操作的延遲。故配備外置電腦控制雙進(jìn)樣器移液、并自動記錄測試值，顯然是必要的。對于高通量測試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，則更應(yīng)如此。

（待續(xù)：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測之多功能熒光酶標(biāo)儀解決方案-下）