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光密度值和灰度值如何在Western Blot條帶定量和凝膠圖像分析中應用?
在 Western Blot條帶定量分析時，到底是分析圖像的光密度（Optical Density, OD）還是圖像的灰度值（Grey Levels，GL）？
有觀點認為灰度與光密度兩種量化方法都行，隨意。有人提出WB一般分析都是積分光密度（Integral Optical Density，IOD）。還有的提出灰度應逐漸被光密度或吸光度取代［1］。
就此問題，阿拉斯加科技基于PubMed進行了專題調研。分別采用grey Level + western blot和optical density + western blot兩組關鍵詞，檢索區域限定為[Text Word]和發文時間[PDat：2016/01 - 2021/01]。了解近5年發文中國內外學者的對此問題“主流”意見。對檢索記錄初步整理，結果如下：
檢索詞 | Grey Level western blot | Optical Density western blot | Grey Level immunohistochemistry | Optical Density immunohistochemistry |
論文數 | 87 | 24091 | 151 | 11316 |
(數據來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)
檢索結果顯示，在western blot圖像分析中，采用圖像的grey Levels值與采用optical density值分析的論文數量比為1:276。把發文時限前推至2011/01后，則這一比例為255:18124 = 1:71。換言之，前5年基于光密度值分析的論文比例為98.6%，后5年該比例微升至99.6%，僅0.4%的論文采用條帶灰度值分析。堅持WB條帶定量分析圖像灰度值論者，儼然成了當今的“瀕危保護”人群。
對這87篇基于圖像灰度值進行WB條帶定量分析的論文簡單梳理后發現，部分文章發表在諸如CANCER CELL (2019 IF 26.602)，CELL RES (2019 IF 20.507)，NAT COMMUN (2019 IF 12.121)，THERANOSTICS (2019 IF 8.579，Clin Transl Med (2019 IF 7.919)，BRIT J PHARMACOL (2019 IF 7.73) 等影響因子頗高的著名期刊上。據此看來，基于兩種圖像強度值數據的分析方法，并無先進落后之分，僅僅是使用人群的大小眾的問題。
那為什么眼下呈現一邊倒用光密度值而非灰度值做WB圖像的條帶定量分析？要回答這個問題，還要從光密度和灰度的本質涵義說起。
1. 圖像灰度值
無論CCD還是CMOS傳感器，原理都是光子照射在圖像傳感器光敏面上產生光電效應，像素上激發出電子。在曝光時間內，電子持續生成并在內部電容不斷積累形成電壓信號。電路對每個像素電壓信號進行放大和模數轉化等處理，每個像素對應的光信號用一個0-255之間某個相應數值表示：0表示黑-沒有光信號，255表示白-光信號強度最大，用1-254值表示處于黑白之間的顏色深淺（灰度）。這樣形成了反映拍攝對象各部光線強弱（灰度值）的二維陣列，最終圖像灰度值以數字信號形式輸出，即輸出了數字化圖像。
因此，圖像灰度值代表源自于樣品反射的照明光源（reflective light）、自發熒光或外部激發標記熒光、樣品的生物發光和化學發光等光信號強弱。樣品發射的光信號越強，像素獲得的光子和集聚的電信號越強，形成的像素灰度值越高，生成的數字圖像對應的像素越亮。這樣，圖像亮度（灰度值大小）與可發光樣品多少即濃度/含量，存在關聯（正相關）。
故在凝膠成像分析儀對于采用EB、GelGreen，SYBR Green，SYBR Safe等標記的和SYPRO Ruby蛋白凝膠的熒光染料激發熒光、自發熒光，Western Blot印跡膜HRP-ARP化學發光樣品采集的圖像，應該采用灰度值分析法分析。
2. 圖像光密度值
要說清光密度（Optical Density, OD）的涵義，還須從比爾-朗伯定律（Beer–Lambert law）或朗伯-比爾定律（Lambert–Beer law）開始。
朗伯-比爾定律是光通過物質時被吸收的定律，作為吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎理論，適用于電磁輻射和所有吸光物質（包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子）。其物理意義是當一束平行單色光垂直通過某一均勻、非散射吸光介質體系時，因介質吸收了一部分光能，在透過一定厚度介質后，透射光的強度減弱。如介質中的吸光質點之間無相互作用，入射光與介質內部之間的作用僅限于光吸收,無熒光和光化學現象發生，且介質的吸光度在0.2-0.8之間。此時比爾-朗伯定律數學表達式成立：
其中：I為透射光強度，I0為入射光強度；吸光度(Absorbance, A)指光線通過溶液或介質前的入射光強度I0與該光線通過溶液或物質后的透射光強度I比值的對數.
而光密度(Optical density, OD)同樣定義為入射光與透射光比值的對數。故本質上，光密度(OD)等同吸光度(A)［2］。
光吸收介質的濃度愈大，厚度愈厚，則入射光穿透介質后光強度的減弱愈顯著，對應的吸光介質的吸光度（光密度）越大。光路上樣品濃度/含量大，則光密度大，落實到光學成像上，光密度掃描儀和凝膠成像分析儀等采集到的圖像越暗。
標準光密度法適用于采用透射光(transmitted light)成像檢測獲取的圖片的量化分析［2］。即：進入圖像傳感器采集的光信號與檢測入射光線為同一束光（而非樣品經入射光激發后產生的熒光、自發熒光或生物、化學發光），樣品含量與對檢測入射光的吸收削減作用呈線性關系，都可以基于圖像的光密度值進行量化分析。
根據比爾-朗伯定律，凝膠成像分析儀使用白光轉換板采集的考馬斯亮藍染色蛋白電泳凝膠圖像，比色分析實驗圖片和采用光密度儀掃描采集的放射線自顯影膠片圖像，應該采用圖像光密度值為依據進行量化計算［2］。
如入射光與吸光介質內部之間并非限于光吸收,同時激發產生了熒光（如入射光源為302nm紫外光，激發核酸標記EB染料后發射595nm波長橙紅色熒光），或有光化學現象發生，此時，圖像感光器接收的光信號，比爾-朗伯定律不再適用。
3. 光密度與灰度的轉換關系
數字化圖像記錄的是各像素的灰度值，但不同樣品因成像機制不同，圖像的黑與白所代表的含義存在根本區別。因此，應回歸圖像本來內涵，選擇到底是基于圖像的光密度值抑或圖像的灰度值，對圖像進行量化統計分析。
在軟件ImageJ 1.46r的操作指南中［2］ ，專門給出了像素未經校正的初始光密度值（Uncalibrated OD）和像素灰度值間的轉換公式。即：
而UVP VisionWorks LS軟件操作指南［3］中，給出圖像特定像素P(x,y) 經校正后OD值與像素灰度值的計算公式如下：
當P(x,y) < black（即黑色圖像白色背景）時：
其中，Incident =整個圖像中最亮的像素值，Black =整個圖像中最暗的像素值。
當P(x,y) ＞black（即白色圖像黑色背景）時，公式2可表述為：
比較發現，公式1和公式2、3，本質含義一致的。
兩個軟件給出的公示傳遞的信息是：
無論暗底亮條型圖像（如Western Blot原始圖像、EB等熒光染料標記的DNA電泳凝膠圖像），還是亮底暗條型圖像（如經典的采用放射性自顯影方法檢測的Western Bot底片圖像，可見光照明下考馬斯亮藍染色、銀染的蛋白凝膠圖像），計算機記錄的是圖像像素強度值（pixel value）都是灰度值（grey Levels）。
可見，不同實驗圖像，無論是普通凝膠圖像，還是Western Blot條帶圖像，灰度值所代表的內涵并不一致。
提示，在對圖像量化分析時，所分析圖像強度值，到底是像素灰度值，還是光密度值來，必須結合圖像本身屬性，心中有數。WB條帶定量中到底是分析圖像灰度值還是光密度值，泛泛而談則毫無意義。
4、結語
把NIH在生物醫學界人士心中的地位比作阿拉伯民眾眼中的麥加城，并不為過。但凡研究生開始就從NIH的PubMed數據檢索和免費便捷下載服務受益的生物醫學研究者，對NIH信息平臺服務的信賴，是不言而喻的。
20世紀80年代初，為解決x光片圖像分析處理難題。NIH的程序員韋恩?拉斯班德（Wayne Rasband）編寫了ImageJ分析處理軟件，從此，研究人員得以在計算機上查看和分析數字圖像。
這款軟件因為功能強大、權威性和無償分發使用模式，其圖像分析應用的影響力，早已超越生物醫學圖像范疇，被拓展到到諸如地質地理、材料科學、農業食品、城市建設、園林綠化等等眾多領域。2021年，Nature雜志將ImageJ列為改變科學10個計算機代碼項目之一，可見一斑。
本文得以成文，也正是受ImageJ的User Guide啟發的結果。
關于Western Blot條帶定量分析到底是基于條帶光密度還是灰度值的問題，總結起來三句話。
1）因圖制宜
暗底白帶型WB條帶圖像的分析值，理當是基于圖像的灰度值GL；而目前發文中千篇一律的淺底暗帶圖片（仿經典放射性自顯影風格），分析時理應將原始灰度值數據轉換為OD值后再分析比較。至于有學者認為圖像分析揚棄圖像灰度值分析法，我們認為：要依圖片屬性來定。
2）實事求是
發文如提供了圖像強度（Density / intensity）統計分析指標，則應跟于上一條的規則，明確分析數據是條帶圖像的OD還是GL，不可張冠李戴混為一談。
3）灰度分析靠譜
在ECL法學發光成像的原圖直接采用選區灰度值進行量化分析，不僅方法沒錯，事實上基于灰度值的統計分析完全可行。詳情可參考《圖像灰度值在Western Blot條帶定量分析中應用實測》（上、下）。
參考文獻：
1. 李楓.圖像分析中光密度參數物理意義的正確理解和使用.解剖學雜志，2009,32(2):271-274
2. ImageJ IJ 1.46r User Guide
3. Life Science Software Installation and User Instructions Rev L (81-0254-01)
