使用倒置顯微鏡在相差成像模式下對未染色活細胞的觀察與圖像采集是細胞培養實驗中的基本操作。

        倒置顯微鏡的透射光照明光源(transmitted-light illumination或dia-illumination)，不管是配置LED冷光源的Olympus CKX53、Leica DMi1、DM IL LED，還是配備鹵素燈照明的麥克奧迪AE2000倒置相差顯微鏡，透射光路上光源與聚光鏡之間設有濾光片架（Filter Slot, Filter Holder或Filter magazine），用于安裝透射光濾光片（transmitted light filter）。不同機型適用的濾光片直徑大小、可容納濾光片數量不等。此外，不同個案隨機提供的濾鏡功能類型和數量有別。而論文發表編審環節對細胞圖片質量并無特定要求。因此，在實際細胞成像操作中，透射光濾光片的運用容易被忽視。

        雖然透射濾光片售價不過區區數百元，對顯微鏡整體造價的影響甚微，但確是倒置相差顯微鏡系統配置時須慎重斟酌的可選元件。此外，明場、相差、DIC和霍夫曼浮雕相襯觀察模式下對光路中光學元件檢查調整操作，常視作顯微鏡成像設置的標準步驟載入廠商操作指南。

        本文嘗試對細胞明場成像常用的透射光濾光片作一總結，以饗讀者。

一、倒置顯微鏡常用透射光路濾光片的功能類型

1.1 中性密度濾光片（Neutral Density Filter, ND）

        中性密度濾光片，也叫灰色濾光片（Grey filter）、中灰濾鏡、中性衰減片等，簡稱ND鏡。它采用特殊吸光材料制成，對波長400～700nm范圍的可見光亮度具有均衡、中性無差別的衰減作用，而對入射光色溫（color temperature）影響小，故稱為中性密度濾光片。

        光密度（Optical density, OD）常用來代表光通過透明介質時的衰減程度（介質的對光的吸收程度）。入射光強度一定時，介質吸收光強度大，則透射光強度小。用透光率（T%）來表示光線透過介質的能力。

        根據鏡片材料OD值的不同，不同光密度ND鏡用“N+數字”的方式標示其，N后面數字代表鏡片OD值。透光率(T%)與OD值間的換算關系為T%=100/N。

        以N16濾鏡為例，它代表穿透鏡片的透射光強度減少到入射光強度的100/16 = 6.25%。

        培養細胞圖像采集中使用的光吸收式ND鏡常用規格有：

        ND2：透光率50%（透射光亮度減至入射光之1/2）；

        ND4：透光率25%（透射光亮度減至入射光之1/4）；

        ND8：透光率12.5%（透射光亮度減至入射光之1/8）；

        ND16：透光率6.3%（透射光亮度減至入射光之1/16）。

        ND后面的數字越大，減光能力越強，同等曝光設置條件下所采集的圖像越暗。如要提高鏡下視場亮度，應選用N后數值較小的ND鏡。不同光密度類型的ND鏡既可以單獨使用，也可以多片ND鏡組合使用，使得對視場照明亮度的調控精細化。

        在細胞相差觀察中，當照明光源的亮度、視場光闌（Field diaphragm）、聚光鏡頭的孔徑光闌（Aperture diaphragm）保持一致，則同一視野樣品的透射光強度在用不同放大倍率物鏡觀察時是不變的。從低倍鏡切換到高倍鏡觀察時，高倍物鏡數值孔徑（Numerical Aperture, NA）大于，故高倍物鏡的光通量大，獲得的圖像更亮。

        雖然調節光源的亮度固然可調整視野明暗，但光源亮度調整的同時，往往容易造成光源色溫變化。這一點在鹵素燈透射光源中表現得尤為明顯。

        而調整聚光鏡孔徑光闌也能減少視場通光量，但圖像細微結構分辨能力會因此而受損。

        此時，將數字較高的ND鏡轉入光路來降低視場亮度，可替代對顯微鏡照明亮度控制按鈕的調節，有利于維持不同倍率物鏡下圖像亮度趨于穩定、圖像反差對比，保持圖像拍攝條件和圖像質量的可再現性。

        用ND濾鏡調整透射照明光亮度，操作簡便且便于統一，又不影響光源色溫及圖像分辨率，因此是細胞倒置成像操作中亮度調節的首選方案。蔡司Axio Observer 7、Axiovert 5、Primovert 顯微鏡的Grey filter 0.25與Grey filter 0.06，Olympus CKX53、Olympus IXplore Standard（IX73）及Olympus IXplore Pro （IX83）顯微鏡的45-ND6、45-ND25都屬于ND濾鏡。

1.2 色溫轉換濾光片（Colour Temperature Conversion Filter）

        色溫即光源的顏色。用于衡量光源色彩的尺度是基于19世紀末英國物理學家開爾文勛爵（Lord Kelvin）的“黑體”（black body）熱力學-光轉換理論建立的。“黑體”受熱后會呈現不同顏色。隨著溫度由低到高，“黑體”依次向外輻射黑-紅-黃-白-藍的可見光。按這一原理，任何可見光的顏色皆可對應于“黑體”在某個溫度輻射光的顏色。藍光對應于“黑體”高溫，而紅光與“黑體”較低溫度相對應。因此，可用熱黑體輻射相同顏色可見光時的熱力溫度值來代表光源的色溫。色溫的計量單位為開爾文(Kelvin, K)。例如，暖白色白熾燈光色溫約為2700K，普通日光燈光色溫約為6000K，而正午陽光的色溫約5000K。

部分倒置顯微鏡型號透射光源色溫

        倒置相差顯微鏡數碼相機所采集的透射光顏色是透射光源、培養基和細胞綜合作用形成的。不同實驗室、不同批次樣品所獲得的細胞相差圖像色溫差別很大。暖色調透射光環境下細胞圖像色調整體偏黃，而冷色調透射光下采集的圖像偏藍。

        既要確保用于發表的細胞圖像資料真實準確和可重復性，又要改善細胞圖像的對比度和內部結構細節的有效呈現，提高發表圖片質量，利用色溫轉換濾光片對細胞樣品透射光源進行色溫調整是細胞圖像采集過程中行之有效的常規操作方法。

        用色溫校正濾光片調整光源色溫遵守的是光色互補原理：采用對紅色和綠色通道增強，對藍光減弱提高圖像黃色占比，達到暖色效果；反之，增強光源中的藍光或同時減少紅綠光，即可降低色溫。

        用于調整光源的色溫濾光片有降色溫濾光片、升色溫濾光片兩大類。降低光源色溫的濾光片為琥珀色（橙色）系濾光片。升色溫濾光片為藍色系濾光片。隨濾光片顏色深淺程度不同，對光源色溫降低幅度有所不同：顏色深，降色溫作用明顯；顏色淺降色溫效應小。

Leica DM IL LED倒置熒光顯微鏡可選色溫轉換濾鏡表

        蔡司Axio Observer 7、Axiovert 5倒置熒光顯微鏡的Conversion filter（5700–3200K, d=32 mm）色溫轉換濾光片用于將5700K色溫的LED光源轉換為色溫3200K鹵素燈光。

1.3 對比度增強濾鏡（Contrast enhancement）

        對比度是指一幅圖像最明亮區域和最陰暗區域間亮度層級的差別程度，即圖像中亮和暗之間灰度反差的大小。

        較低的對比度，圖像明暗區域間的過渡平滑柔和，明暗區帶間界限模糊，圖像整體缺乏層次感。高對比度圖像中的亮度差異強烈，明暗區域的界限清晰，目標輪廓突出，出立體層次感明顯。但容易造成細節損失、高光區域過度曝光產生光暈或局部區域曝光不足，圖像質量下降。

        采用閾值設定、邊緣檢測和形態學檢測細胞的方法用于細胞圖像自動化分析中，細胞分割是基礎。細胞相差圖像中，只有分析對象與背景有足夠的對比度，分析軟件才可以在圖像中識別和檢測到分析目標。若細胞圖像中細胞與背景的灰度級有較強重疊，差異極小。一般的閾值類方法難以從背景中分割出細胞，影響圖像分析中細胞計數、細胞形態、細胞融合度等檢測數據準確性。

        倒置相差顯微鏡增強圖像對比度的方法是引入圖像對比度增強濾光片。

        對比度濾光片，又稱反差濾鏡，是黑白攝影（如未染色細胞相差圖像采集）中改變被攝景物的色調以提高對比的濾光鏡。其運用方法為：提高光源中某種色彩的比例，使該色光線增強，在圖像中的灰度值上升，色澤變淺（變白）；相反，如要降低色彩灰度值，使之在圖像中色澤加深（變暗），則采用對該色光有吸收濾過作用的濾光片，削弱該色彩的光線。要使某色種色彩在圖像上的色調變淺時（信號降低，圖像灰度值降低），用允許該色光通過的濾光片；反之，若要使某種色彩在圖像上的色調加深，則使用可濾除該色光的濾光片。有多種長通、短通、帶通濾光片可用于色彩增強，提高圖像對比度。譬如，黃色濾光片可濾除藍、紫色，允許黃色光及紅、橙、綠色光通過。藍色濾光片濾除紅橙黃綠色，允許波長較短的藍光通過。

        倒置顯微鏡下的細胞相差圖像是基于穿透細胞的直射光與細胞衍射光間干涉原理形成的。常用的對比濾光片是綠色干涉濾光片(Green interference filter , GIF) 。這種濾光片能有效地過濾掉照明光源中的紅、橙、藍、紫色，運行綠色和黃光通過，可以有效地增強光源中黃綠色光，削弱藍光，提高LED照明光源的色溫，提高圖像黑白對比度。透射光源以藍綠光為主，相差干涉圖像銳利，細胞的細節特征呈現更清晰，故特別適適合無標活細胞的觀察及拍照。Leica DMi1倒置相差顯微鏡的Green filter （11526125），Olympus CKX53/IXplore Standard/ IXplore Pro 的550nm Green Interference Filter（43IF550W45）皆屬于對比度增強型濾光片。

        此外，黃綠色濾光片、黃色濾光片具有增強培養細胞圖像對比度的功能。Leica DMi1 Yellow filter（11526126）就屬于這一功能類型。

二、其它倒置顯微鏡透射光照明濾光片

2.1 照明漫射濾光片（Frost Diffusion Filter）

        顯微鏡視場照明光分布不均，造成的細胞相差圖像亮度不均衡，會對圖像分析過程中細胞的識別、粘連細胞的分割、形態學檢測和細胞準確計數產生干擾。

        漫射濾光片由內含光散射物質的玻璃制成，其透射光比毛玻璃更均勻，可為樣品提供更均勻、柔照明效果。Olympus IXplore Standard（IX73）、IXplore Pro（IX83）顯微鏡的45mm Frosted Diffusion Filter等即屬于此類用途的濾光片。

2.2 白平衡（White Balance）調整濾鏡

        不同細胞、培養基和照明光源條件下，數碼相機采集的培養細胞透射光圖像，獲得的圖像色溫存在區別。LED光源視場下獲得的圖像色調偏藍，而鹵素照明燈光下拍攝的圖像偏黃。對在特定光源下拍攝時圖像偏色現象，可通過加強光源的互補色（如紅色與藍色）來修正。將在不同環境色溫中白色物體調整成人眼視覺習慣的白色，叫做白平衡調整。如LED白光照明光源白色偏藍，那么白平衡調整方法就是減弱藍、同時增加綠和紅光比例，使所成圖像呈現為白色。

        白平衡濾光片特別適合染色細胞和組織切片的觀察和成像。Olympus IXplore Standard（IX73）、IXplore Pro（IX83）顯微鏡提供的Light Balancing Daylight Filter（45-LBD-IF）即屬白平衡濾鏡。

2.3 吸熱濾光片

        可吸紅外波長光線的玻璃濾光片，可減低照明光中的熱輻射對標本的影響。

參考文獻

[1] 機標JB/T 8226.5－1999—《光學詢價件薄膜·中性濾光膜》

[2] 張勇喜, 金秀, 楊文華, 等. 中性密度濾光片中性程度評價方法[J]. 光學儀器, 2013, 35(5): 85–89.

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[7] 吳京城，施露露，杜亞南等. 基于雙重高斯濾波的細胞圖像快速分割方法[J]. 激光與光電子學進展, 2022, 59 (2): 0210002, 網絡出版