厭氧工作站（Anaerobic Workstations），也稱作無氧實驗艙、厭氧培養箱（Anaerobic Chambers），是具有封閉艙體、可調控艙內氣體組成與含量、溫濕度條件的多功能實驗箱。其核心功能是將艙內氧氣含量控制在5 ppm（氧體積百分比0.0005%）以下，為厭氧微生物的樣品制備分離、培養和鑒定提供了持續、穩定的無氧環境。工作艙既是優良的樣品準備場所，又是標準的恒溫恒濕厭氧培養箱。因此，作為基礎條件裝備，厭氧工作站已廣泛而深入地應用在臨床醫學與動物疾病預防、致病菌藥敏鑒定、食品工業發酵、極端微生物研究、微生物組研究（Microbiome Studies）、環境微生物學及生物能源研究等多學科領域。

       與生物安全柜、恒溫培養箱、恒溫搖床等其它微生物實驗設備相比，厭氧工作站的系統結構、參數控制、操作流程和運行條件要復雜。為便于讀者自覺、安全地使用與維護好厭氧工作站，本文從厭氧工作機制出發，來討論工作站運行的氣體管理問題。

一、厭氧工作站的除氧機制

       厭氧工作站通常采用物理手段（抽真空排氣、氮氣填充稀釋）與化學手段（鈀催化劑除氧）相結合的方法來簡便高效地除去工作艙內氧氣。

       先啟動真空泵，快速地將工作艙內大部分空氣排出，但仍有少量空氣的稀薄分布。

       隨后向艙內緩慢填充99.99%食品級高純氮氣（N₂），目的是將殘留空氣大幅稀釋。充氣完成后立即啟動真空排氣，完成一次氮氣置換操作。氮氣置換操作重復1-2次后，艙內O₂殘量可低至0.1%上下。因真空泵工作性能及箱體結構強度限制，再繼續增加氮氣置換操作循環次數，對進一步降低艙內O₂含量不僅收效甚微，而且耗時、費氣。此時，需要執行混合氣置換與鈀催化劑化學除氧流程。

       鈀催化除氧的基本過程是：在2輪氮氣置換操作完成后，向工作艙內輸入含5%或10%比例H₂的厭氧混合氣體（anaerobic mixed gas, AMG），即混合氣置換操作。借助于金屬鈀對H2的強大吸附作用，用風扇使艙內氣體循環流經鈀催化劑層可將O₂捕獲，并迅速催化O₂與H₂反應生成H₂O，氣流將水蒸氣帶走。當艙內相對濕度過大時，工作站配備的濕度自動控制單元將其冷凝后收集并導出艙外。

       DWS公司的A20/A25/A35，Shellab公司的Bactron 300-2，龍躍LAI-3T-N20等新型厭氧工作站，采用了自動厭氧氣體置換循環控制功能（automatic commissioning cycle）。按下此功能鍵后，無需人工干預，系統自動啟動2輪氮氣+1輪混合氣的標準置換操作流程，直至工作站實現厭氧狀態。

       厭氧工作站的化學除氧環節選擇鈀催化劑（palladium catalyst），有2個重要原因。

       一是鈀金屬對H₂、O₂所特有的超高吸附能力。

       氣態分子和固金屬表面的吸附是異相催化的基礎。鈀（Palladium, Pd）是鉑（platina, Pt）系過渡金屬元素，原子容易失去外層d軌道上的電子。吸附于金屬表面的H2分子獲得電子后，分子內部H-H鍵斷裂，解離成H原子而活化，與Pd原子形成Pd—H共價鍵或Pd—H吸附鍵，這一過程稱作解離吸附（dissociative-adsorption）過程。正是Pd—H化學鍵的形成，使鈀表面吸附H2效率極高。常溫下，海綿網狀鈀催化劑表面可吸附相當于自身體積850倍的H₂。

       大量活性H原子吸附在鈀網表面，并可在鈀表面自由移動，如同鈀催化劑布置的巡邏兵。當遇到循環氣流送來并與鈀吸附的O₂時，憑借數量優勢的H原子與O原子結合秒變成水，而水分子則自動從催化劑表面脫吸并被艙內循環氣流帶走。

通常，工作艙內氣體經過數十分鐘循環后，O₂含量即可控制在可接受的5ppm以下的安全水平，滿足厭氧實驗樣品工作要求。

       二是鈀催化劑的經濟性。

       鈀制劑的催化活性、穩定性和選擇性俱佳，早已在石油、化工、制藥和汽車發動機尾氣處理等工業生產中實現了規模化應用和量產。因此，厭氧工作站采用鈀催化劑除氧的方法，不僅技術上成熟、可靠和高效，而且鈀制劑易于獲得。

       將厭氧工作艙內的空氣置換成厭氧氣體環境走的是真空-氮氣稀釋-鈀催化除氧的基本技術路線。而將艙內氣體長期維持在安全厭氧水平，也是這一思路。

       正常運行狀態下，工作站厭氧狀態維持，主要是通過N₂吹掃和厭氧混合氣體補充這2個措施來保障的。

1、進站N₂吹掃（flush lock），阻斷外來氧源

       外來O₂進入工作艙主要通過實驗樣品容器轉移艙（Flushing interlock or airlock）和手部操作窗（glove ports or sleeved ports）兩個途徑。

       為便于培養操作器皿、小型儀器和樣品的批量轉移。標準尺寸的厭氧工作站通常都設置專用的樣品轉移艙。轉移艙有內、外兩道密封門。內門打開后直通工作艙。外門開啟時與實驗室環境連通。內外門不可同時開啟，以防止工作站內、外空氣的直接對流。

       DWS A25、A35厭氧工作站具有轉移艙內門、外門和氮氣吹掃聯動智能管理功能：內外門中任一道密封門處于開啟狀態，系統會自動限制另一扇門的開啟，確保內外門不能同時開啟；此外，轉移艙未完成氮氣吹掃時，也無法打開內門。這樣可有效防止人為操作失誤破壞內部厭氧環境。

       正常情況下，在內門關閉狀態下，從工作站外將所需容器放入轉移艙后并封閉外門后，立即進行轉移艙N2吹掃操作。N₂吹掃與工作艙物理除氧原理和方法基本一致。

       厭氧工作站正常運行時，艙內氣體對于站外空氣、轉移艙始終保持一定正壓水平，萬一工作站發生漏氣，正壓可阻止艙外空氣進入艙內。轉移艙處于保壓狀態時，內部氣壓低于工作艙氣壓也是出于同樣考慮。

       轉移艙N₂吹掃設置真空抽排氣，主要是基于兩方面的考慮。

       首先與厭氧工作站氣體工作壓力設置有關。英美品牌工作站的工作氣體輸入表壓為0.2-0.6Mpa以上（2-6個標準大氣壓），高于轉移艙內的氣壓。電磁閥開啟，氣體即可自動流入和充填氣壓較低的轉移艙。而龍躍LAI-3T-N20等國產工作站所用的吹掃氣瓶輸出氣壓通常為0.05-0.08Mpa（0.5-0.8個標準大氣壓），不僅低于工作艙、轉移艙內氣壓，也低于站外空氣氣壓。因此，工作站內各艙段氣體置換過程的充、排氣都離不開真空泵的運行。特別是排氣階段，真空泵可令氣體清除更徹底。

       其次是更有效地消除轉移物品攜帶的氧氣。真空排氣過程中，被轉移器具內部空腔所攜帶常壓空氣、樣品溶液中的溶解氧氣因真空效應更易于逸出而被一并抽離，減少隨器皿轉移帶入的氧氣。

       轉移艙的N₂吹掃通常要進行2個循環，以盡可能驅除艙內空氣。通常，在2輪N₂吹掃循環后還可增加一個混合氣充填步驟，再將物品轉入工作艙。轉移艙容積不過10-40L，吹掃操作可在15-20分鐘內完成。吹掃過程也可由自動程序控制來完成。

       袖套式操作窗通常也需執行N2吹掃操作。

2、厭氧混合氣補充消除氧氣增量

       N₂吹掃循環通常難以徹底消除實驗用品具、手部出入工作站時吸附于皮膚以及手與乳膠手套間隙中攜帶的少量O₂。此外，而艙內樣品溶液所攜帶的氧氣也會陸續釋出。

       厭氧工作站配置的氧氣指示劑或高精度氧氣傳感器，用于指示艙內O₂含量。

       當外源性氧氣積聚勢必造成艙內氧含量的上升。當升幅足以觸發氧傳感器讀數改變或指示劑顏色改變足以為操作者肉眼可分辨的程度時，在手工操作或系統PLC自動控制下，向艙內緩慢（通常流速可低至10mL/min）注入相應體積的氫氣，將多余的O₂清除，直至艙內重新恢復到安全厭氧狀態。

二、厭氧工作站運行配套氣體需求

       厭氧工作站運行的氣體有兩種，高純度N2和混合氣體AMG。N₂的作用是用于工作艙、轉移艙和袖套的氣體置換，工作流速可高達10-25 L/min，消耗量大。AMG主要作用包括氣體置換和運行過程化學除氧兩方面。可見，兩種氣體中，AMG是剛需。

       AMG是由N₂、H₂和CO₂三種氣體按一定比混合后制成的。既然N₂、H₂即可滿足運行要求，為何要添加CO₂？這是由N₂、H₂和CO₂三種氣體各自的生產、儲運條件特殊性決定的。

       N₂的臨界溫度（Curie temperature/Tc，即物質氣、液態共存并達到平衡時溫度）-146.9℃，臨界壓力3.3978 Mpa。只需常溫下將N₂加壓到3.3978 Mpa，或在常壓下將N₂氣降溫到-146.9℃，就可獲得液氮。

       CO₂的Tc為31.1℃，臨界壓力7.3 Mpa。常溫下加壓到6.0 Mpa就可得到液化。液態CO₂可在-37℃下穩定儲存。

       H₂在標準大氣壓下冷卻至Tc -240℃后才能液化，且液氫須在-253℃低溫容器中儲存，生產、儲運成本遠高于液N₂和CO₂。

       液氮生產成本低，液氫儲存使用條件苛刻。液態CO₂不僅成本較低，重要的是通過添加CO₂將液態混合氣體的沸點溫度升高，對提高儲運和使用的安全系數大有裨益。

       實踐中，厭氧工作站有單一AMG供氣（Single Gas Configuration，SG）和N₂+AMG雙氣體供氣（Two Gas Configuration, TG）兩種運行模式。

       工作站運行氣體消耗量，與工作站的使用頻率、轉移艙內部容積大小和物品出入次數有關。

       Mini Station、AG300及Basic I這類迷你型、小型厭氧工作站，系統氣路及氣體控制單元結構簡化，小型化設計有利于降低建造和購置成本。小巧的工作艙空間不過130L，單一AMG實施各艙段氣體置換和厭氧環境維持的氣體消耗仍十分經濟。據悉，Mini Station厭氧工作站單一AMG氣體工作模式下，標準40L容量鋼瓶（≥10m³氣體）可持續供氣多約28周。

       而標準尺寸厭氧工作站，工作艙容積300-500L，轉移艙容量40-50L，采用單一AMG氣體運行，標準40L氣瓶可持續供氣2-3周。通常，大容量工作站用戶采用雙氣工作模式的運行成本更低。A20、A25、Bactron 200-2等小型工作站以及A35，Bactron 300-2，E400、E500G、LAI-3DT及LAI-3T-N20等標準型厭氧工作站，都采用了雙氣運行模式。這類工作站機身設有N₂和AMG兩種氣體輸入接口，系統的氣路結構及氣體控制單元相對復雜。

       厭氧工作站的PLC控制芯片是根據O₂傳感器測試值，基于內置算法來通過控制AMG氣體流量來調控工作艙氧含量。如AMG氣體組成及比例與系統控制標準不匹配，必然危及艙內厭氧環境的安全穩定。

       目前，厭氧工作站用的AMG組成比例有兩個技術標準。

       英式AMG標準設定的氣體組成比例為80%N2+ 10%CO2 + 10%H2。英國DWS的A25和A35，Electrotek 品牌AW200SG與AW300SG，江雪MiniStation、E200、E500系列厭氧工作站即執行該標準。

       美式AMG標準規定氣體組成比例為5% CO2+5% H2+90%N2。Shellab品牌的Bactron 200-2、Bactron 300-2系列工作站，龍躍LAI-3DT等厭氧工作站沿用該標準。

       實際工作中，AMG的訂購和使用須嚴格依具體設備型號所執行AMG標準執行。

三、結語

       厭氧工作站是采用小型氣泵按固定流速抽取艙內氣樣輸入檢測單元來測定和指示艙內氧含量情況的。因采樣點、采樣流速和工作艙內部容積大小的限制，系統厭氧狀態指示所反應的只是某個時段、局部厭氧狀態，具有時間上的滯后性和空間局限性，并非工作艙內所有位點、所有時段氧含量的真實水平。

       而實驗器具（移液器、吸頭、移液管、培養皿、試劑瓶、培養瓶等）及試劑溶液攜氧難以避免。如剛移入工作艙便立即進行厭氧操作，這部分輸入性氧分與艙內氣體交換，會造成厭氧狀態波動，但卻難以及時被系統氧檢測或指示單元所感知，造成系統除氧反應滯后。實驗器具越多，器具用品內部充氣空間和溶液體積越大，則輸入性氧成份污染危害越大。

       我們建議，大量站外實驗用品輸入工作艙后，應將器具開蓋靜置足夠時間，確保輸入氧氣釋出、觸發系統厭氧維持機制后，再實施氧敏感樣品的操作。

主要參考文獻

［1］LAI-3厭氧培養箱使用說明書
［2］AG300厭氧工作站使用說明
［3］Labgic AI-TS-5厭氧培養箱操作說明書(2022.7版)
［4］DWS A35厭氧操作培養箱操作說明
［5］Anaerobic Workstation AW400TG Two Gas Version Manual
［6］BACTRON Anaerobic Chambers Installation and Operation Manual（Rev. July 8, 2022）