（續:MIQE指南對qPCR實驗中核酸紫外測定的要求-上）

三、實時熒光定量PCR實驗MIQE核酸質控規則的實際運用

       資料顯示，如同MIQE指南本身在國際學術期刊的文稿發表審稿環節實際貫徹落實情況的遭遇，不同期刊對文章qPCR實驗checklist的要求并不一致。整體上，按文章中對核酸質量控制過程細節披露的詳略不同，常見3種情形。

3.1用心良苦型

       皮膚淀粉樣變性(Amyloidosis cutis dyschromia, ACD)是主要發生于東亞和東南亞族群的不完全外顯的常染色體顯性遺傳疾病。糖蛋白非轉移性基因 B (glycoprotein non-metastatic gene B, GPNM-B)編碼的GPNM-B跨膜蛋白，在表皮的黑色素細胞中表達最盛。正常情況下，GPNM B蛋白與自噬蛋白和吞噬小體共定位，參與自噬蛋白被招募到吞噬小體，與溶酶體與吞噬小體融合，促進黑色素小體的形成。ACD個體發生的基因突變造成GPNMB蛋白分子截斷、在胞質中顯著降解和錯誤細胞定位，導致對黑色素小體的形成、吞噬作用等負調控功能的缺失，造成 ACD中黑色素失調和淀粉樣變。對轉染野生型、突變型GPNM B基因cDNA質粒的HeLa細胞中GPNMB mRNA表達水平檢測證實，突變體GPNMB mRNA的表達水平明顯低于野生型轉錄本。實驗中，NanoDrop 2000（相當于NanoDrop One）被運用于以下操作：

1）從HeLa細胞提取總RNA經DNase處理后的總RNA的純度(purity) (A260/A280、A260/A230比值)和濃度 (concentration)測定（A260）。其結果為：A260/A280≥1.9，A260/A230≥2，總RNA濃度386–466 ng/μL；

2）取1μg總RNA（約2-3μL提取液）反轉錄合成cDNA；

3） qPCR反應的cDNA用量：上一步反應合成的cDNA（反轉錄產物cDNA產量和濃度測定值不詳）經10倍稀釋后，每孔取2μL稀釋cDNA模板，500 nM正、反向引物組, 2× SYBR Green PCR Master Mix在384孔PCR板上構建10 μL反應體系完成RT-qPCR和溶解曲線分析。

GPNM-B基因外顯子測序樣品的準備過程，同樣采用A260/A280、A260/A230比值檢驗核酸純度（A260/A280≥1.8, A260/A230≥2）、Qubit 2.0熒光染料法測定DNA濃度，還增加1%瓊脂糖凝膠電泳分析步驟以驗證DNA是否存在降解。 

3.2中規中矩型

       這部分刊文的qPCR實驗，核酸樣品質量評估控制環節，一般通過測定260/280、260/230兩項指標來評估所提取的核酸樣品的純度和濃度，測定指標的披露往往被省略。

       由于細胞在3D培養基質支持下懸浮生長比常規2D體外培養更接近在體內真實環境生長細胞所具有的形態、增殖、分化、遷移和基因表達等特征。因此3D細胞培養體系統可用于疾病模型構建、藥物篩選、細胞治療和再生醫學研究等領域。采用液滴微流控技術在單個細胞的周圍構建起三維水凝膠基質環境，可精確控制細胞周圍三維凝膠的沉積量。當間充質基質細胞粘附于較薄凝膠時，其體積擴張得更快，具有更高膜張力和增加成骨分化功能。間充質干細胞成骨分化標志性基因表達分析實驗中，RNA質量評估是這的：純化的總RNA被重懸于15μL RNase-free water (注：模擬中性pH環境)，NanoDrop 測定RNA 的濃度和質量（concentration and quality）；反轉錄采用Superscript-III reverse transcriptase試劑盒；每個qPCR反應孔為50 ng cDNA用量。

       文中沒有披露RNA濃度、質量具體測定指標、測定值、反轉錄RNA用量。但給出cDNA用量，說明作者是測定cDNA的濃度后再根據吸取體積計算出cDNA含量。

       另一個近紅外光免疫療法(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)抗腫瘤療效及機制的研究實驗中，用Nanodrop測定260/280、260/230兩項比值對腫瘤組織的總RNA純度和含量(purity and quantity)進行測評；取2μg 的總RNA用含RNase抑制劑的反轉錄試劑盒合成cDNA。

       這說明實驗人員在測定總RNA的A260后，根據儀器給出濃度（μg/μL）值和移液體積計算出反轉錄總RNA用量。但文中沒有提供實時熒光定量反應的cDNA用量，故無法得知是否進行過cDNA濃度的測定。

3.3 一筆帶過型

       大量qPCR實驗論文中對核酸質量控制過程描述都過于簡略，與MIQE指南的要求相距甚遠。

       胸腺基質淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可通過激活2型免疫細胞、增加免Treg細胞數量，誘導皮膚分泌脂肪而減少白脂肪堆積，防止肥胖。2021年發表于Science上的這篇高作披露：在對皮膚18個與人類皮膚皮脂生成相關基因和TSLP基因表達檢測分析實驗中，用Nanodrop 1000測定了總RNA的含量。

       另一項對新發現的、與外周血T細胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphoma, PTCL)復發有關的嵌合轉錄本（基因融合突變而產生的融合基因表達的mRNA）FYN-TRAF3IP2、KHDRBS1-LCK和SIN3A-FOXO1的研究項目中，qPCR反應前用NanoDrop 2000測定了嵌和轉錄本的濃度和純度。

       磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1, PGK1）是糖酵解過程的關鍵酶。敲除pgk1基因，抑制了細胞的糖酵解反應，導致小分子代謝物甲基乙二醛(MGx)的積聚，進而使PGK1近端半胱氨酸和精氨酸殘基發生翻譯后的修飾，產生了KEAP1二聚體結構，并伴隨NRF2的積累和NRF2轉錄的激活。揭示了KEAP1-NRF2信號轉導通路在應激反應條件下的細胞代謝功能調控機制。美國斯克利普斯研究所的大V們用慢病毒載體搭載PGK1、GLO1基因靶向shRNA轉染HEK293T細胞進行的基因敲除，靶基因表達驗證實驗部分，用NanoDrop測定總RNA的濃度后取500ng-5μg用于cDNA的合成。

       類似案例不勝枚舉。

       可見，對實時熒光定量PCR反應核酸質量評估環節，紫外吸光度評價法的測定指標，業界認識并不一致。評估方法上重量（Nucleic acid quantification）輕質（Contamination assessment、Purity (A260/A280)）的現象依然十分普遍。

四、討論

       嘌呤、嘧啶、核苷、寡核苷酸或核酸（DNA和RNA）分子因共同的嘌呤環和嘧啶環共軛雙鍵而具有統一的260nm吸收峰特征。260nm的吸光度與所含DNA和RNA、寡核苷酸（PCR引物、探針）的濃度成正比，這是A260用于核酸定量的基礎。蛋白質肽鏈的色氨酸和酪氨酸殘基具有苯環含共軛雙鍵，280nm紫外線吸收峰為其標志，故A280被用于蛋白的紫外測定和計算蛋白濃度。

       在pH中性溶液中，dsDNA的A260/A280比值為1.8；ssDNA、寡核苷酸鏈和RNA的A260/A280比值為2.0。而溶液含有蛋白質（如各種核酸酶、蛋白酶、血紅蛋白、免疫球蛋白等）或酚類殘留時，核酸A260/A280比值將低于1.8/2.0。有觀點認為：RNA樣品的A260/A280比值1.9~2.0屬高純度，1.8~1.9視為輕度蛋白污染，但還可以正常使用；但比值<1.8則視為嚴重污染，可能干擾后續實驗。對于DNA，A260/A280比值＞1.9表明有RNA污染；A260/A280＜1.6，視為蛋白質/苯酚的中度污染。因此，A260測試對應于核酸濃度（concentration）測定，而A260/280比值針對的是核酸純度（purity），用于評估吸收峰波長260nm以上的蛋白、苯酚類污染程度。

       MIQE指南強調A260、A280測定須在pH中性溶液中進行（溶液的pH值改變引起核酸蛋白分子共軛體系的延長或縮短，使紫外吸收峰偏移，測定值相應發生改變。以RNA溶液為例，酸性環境下報告的A260/A280值可能比2.0要降低0.2-0.3，而堿性環境下的測定值則相反。這是造成不同實驗報告中A260/A280、A260/A230比值不同一個不可忽視的重要因素。報告核酸樣品測定結果時，注明測試溶液的溫度和pH值更有參考價值）。眾多文獻中的做法是將核酸溶于不含DEPC、RNase的Thermo Scientific RNase-free water中檢測。而通常，25℃室溫下新鮮超純水pH值約7.0，是最方便的核酸溶劑來源。

4.1 核酸純度評估A260/A280之外是否應引入A260/A230？

       討論這一話題，是因單一A260/A280指標評估核酸純度的準確性業界一直存有爭議。

       首先，因核酸對250nm-270nm范圍的消光系數比蛋白質高很多，少量蛋白污染（如人為加入5%蛋白質）對A260/A280比值（處于1.96-1.99區間）影響有限。只有當蛋白質肽鏈中色氨酸殘基（吸收峰為280nm）比例較高，蛋白的混入才會出現A260/A280比值顯著改變。純蛋白樣品A260/A280比值為0.57，而只需少量核酸混入即可使比值迅速躥升至1.0上下。因此，A260/A280比值最適于對蛋白制品中核酸污染評估，作為指示核酸樣品中蛋白污染程度并不靈敏。

       其次，苯酚、異硫氰酸胍、PEG等提取試劑、雜質，在230nm、260nm、280nm波長附近均有不同程度光吸收，增加A230、A260和A280測定值，會干擾A260/A280比值。譬如苯酚殘留，不僅使A230、A260和A280讀數上升。同時，因其吸收峰與核酸吸收峰合并后整體遷移移至270nm附近。表面上樣品 260/280 比值接近正常或降低，但樣品吸收峰出現在270nm，且存在260/230比值降低現象，實際存在苯酚殘留。再如胍鹽、糖原和碳水化合物等，有230nm的吸收峰，雖不影響A260、A280讀數及260/280比值，但會壓低260/230比值。此時樣品260/280值達標，但260/230<1.6，污染是存在的。

       盡管因DNA、RNA樣品A260/A280比值不同，理論上，基因組DNA殘留會使RNA的比值低于2.0。但基于上述各種復雜情況，僅憑A260/A280比值是無法有效確認樣品提取過程中基因組DNA的污染及嚴重程度的。因此，單一A260/A280比值實現對核酸純度，特別是核酸抑制劑污染的評估，是不全面的。

       克服A260/A280單一指標缺陷的有效辦法是核酸樣品波長掃描分析。以RNA為例，純RNA掃描得到的是一平滑曲線：有A230波谷、A260波峰，A320\A340貼近背景基線；A260/A280≈2.0，A260/A230≈2.0，A260/A215≈1.0。

       部分固定波長的微量紫外光度計，如賽默飛的NanoDrop Lite Plus微量紫外光度計(A230/A260/A280)，無法進行全波長掃描，可用A260/A280、A260/A230雙比值來評估污染物的殘留情況。

       事實上，本文所引文獻中就有實驗采用的是A260/A280 +A260/A230雙比值法。這比SPUD抑制劑測定法，顯然更加快捷、經濟易行。

4.2 如何評估RNA樣品中基因組DNA污染？

       qPCR實驗中，反轉錄合成的cDNA與殘留的基因組DNA都可作為PCR模板被擴增，特別是采用SYBR Green染料標記的測試中，殘留的DNA熒光信號污染會影響定量數據準確性。因此，去除總RNA中的基因組DNA污染，對于采用RT-qPCR方法進行基因表達定量分析具有特殊必要性。

       而完全依賴A260/A280單一指征對核酸污染評估確有潛在風險。

       由于基因組DNA分子量通常比RNA分子量大得多，在凝膠電泳中遷移率存在明顯差異，因此可通過瓊脂糖凝膠電泳予以有效分離和鑒定。通常，總RNA中如有基因組DNA殘留，DNA條帶因為遷移緩慢而滯后于所有RNA條帶，在凝膠上表現為在28S rRNA帶上方、接近上樣孔附件出現新的彌散條帶。MIQE指南規定，須記錄實驗中對RNA樣品經何種DNase酶及處理條件這一細節。同時建議實驗者提供反轉錄操作前樣品的凝膠電泳分析證據。

       增加瓊脂糖凝膠電泳分析，不僅簡便易行，還增進核酸質量評估的嚴謹性和測試結果可靠性。盡管在MIQE指南屬于核酸提取操作中D類審查事項，但本文所引用多篇刊文的實驗中都采用了該方法。

       A260/A280比值之外，MIQE指南要求記錄（測試所用具體方法流程）可耐受基因組DNA污染含量的閾值（the threshold cutoff criteria for the amounts of such contamination that are tolerable.），并報告每個測試靶標核酸樣品孔、陽性對照樣品（內參對照基因）孔和無逆轉錄對照孔（只有RNA而無cDNA，可檢驗RNA樣品在經DNase處理后中是否還有基因組DNA的殘留）的Cq比較結果（the results from a comparison of Cqs obtained with positive and no-reverse transcription controls for each nucleic acid target.）以證明是否存在基因組DNA污染干擾情形。

4.3 簡便易行的核酸樣品PCR抑制劑評估建議

       核酸質量評估控制環節還有一審查事項就是PCR抑制劑污染的評估。

       無論是MIQE指南與人們實際工作中執行的做法是一致的，即采用核酸樣品連續倍比稀釋，根據qPCR標準曲線所計算的PCR擴增效率來證明是否存在PCR抑制劑污染。

       A260/A280 +A260/A230雙比值，可視為PCR抑制劑評估的間接證據。

4.5 MIQE指南紫外吸光度法核酸質量評價環節是否有值得商榷之處？

       首先，MIQE checklist表中反轉錄步驟，用Amount of RNA（RNA質量，即μg或ng質量數）及Priming oligonucleotide concentration都屬于必須報告內容，對qPCR反應cDNA/DNA模板用量不作要求，這不合理。因為cDNA轉錄效率存在一定程度的基因特異性、反應時間依賴性和各廠家試劑盒合成效率差異化的事實，相的總RNA用量、RT酶和RT時間，cDNA合成產量存在差異是完全可以預料的，這勢必導致稀釋后上樣的cDNA輸入量不同，再考慮到不同qPCR儀擴增性能不一致，不明確cDNA起始用量，實驗結果的可重復性和穩定性就是空話。而現實情況是，大量刊文中都標明qPCR反應起始核酸模板用量的做法。

       其次是關于核酸品質紫外評估方法的問題。不僅A260/A230比值是否應該引入問題。對于Contamination assessment (DNA or RNA)與Purity (A260/A280)的內涵與聯系，MIQE也欠一個說明的。從指南原文看，核酸污染評估指的是一種核酸（如RNA）中有另一種核酸(如基因組DNA)的少量殘留污染，并且認為A260/A280比值(Purity測定指標)下降可認定RNA樣品中存在DNA污染。如果Contamination assessment（E類）可用A260/A280比值變化（D類）來準確評估，那把二者分別劃為E、D，本身自相矛盾。除非諸如從微量紫外可見光度計吸光度測定、瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料法、Agilent 2100 Bioanalyzer, Qiagen QIAxcel等中找到了比A260/A280比值更可靠、簡便、經濟的方法，否則，作為一個標準體系，Contamination assessment (DNA or RNA)的可執行性、嚴肅性難免要大打折扣。

        目前無論是綜合應用類常規紫外可見分光光度計（如日立UH5300等），抑或生物學核酸蛋白測定用紫外可見光度計（如eppendorf BioPhotometer Plus、NanoDrop One系列、Implen NanoPhotometer N50及Nano 100/Nano 300等），系統預置的核酸測定工作協議中，A230、A260、A280、A260/A230A和260/A280指標早已用作行業標準。

       足見在核酸質量評價具體指標的問題上，MIQE指南這把寶刀的確有個豁口。

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