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沒有Nano微量紫外可見光度計qPCR核酸濃度純度怎么測?
關于核酸濃度純度測定具體指標的問題,《MIQE指南對qPCR實驗中核酸紫外測定的要求-下》已有專門討論,即核酸純度評估應采用A260/A280、A260/A230雙比值法,核酸濃度測定用A260指標即可,核酸樣品的濃度、純度測定不可偏廢。
主流微量紫外可見光度計的核酸測定應用程序,所建立的標準化的測試和報告體系,通常都具備以下功能特征:
1)若是用非標準比色皿光程進行的吸光度檢測,系統會按先長(光程)后短(光程)的次序自動進行多光程的吸光度測定,自動選擇最佳測試光程(介于1.0mm和0.03mm之間)下讀數作為計算依據。軟件自動將測定初始值歸一化為10mm光程的當量值,用于計算核酸濃度、A260/A230和A260/A280比率;
2)雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)或RNA樣品測定完成,系統默認報告核酸濃度、兩個吸光度比值(A260/A280和A260/A230)和吸光度-濃度換算系數;
3)核酸濃度以選中的單位(即ng/μL、μg/μL或μg/mL)報告。計算公式為:
c=A·f
其中:
A:歸一化為10mm光程的吸光度,以吸光度單位(A)表示;
F:吸光度-核酸濃度計算系數的單位為ng-cm/μL。雙鏈DNA系數為50 ng-cm/μL;單鏈DNA系數為33 ng-cm/μL;RNA系數為40 ng-cm/μL;
C:濃度單位為ng/μL。
以NanoDrop One、NanoDrop OneC微量紫外可見光度計的dsDNA測定為例,測定結果報告自動給出濃度(單位ng/μL)、A260/A280計算值、A260/A230計算值、A260和A280測定值。
NanoDrop One dsDNA樣品測試結果的報告界面還標注了結果計算中采用了340nm 基線矯正(Baseline Correction)算法。正常情況下,純化的核酸樣品吸收波長掃描曲線,存在一峰(260nm吸收峰)、一谷(230nm吸收低谷)和一平(340nm波長開始光吸收降低到0,與檢測器背景信號基線近乎平行)。但因不同測試溶液條件和檢測器自身背景信號,樣品吸光度值可能存在偏差。所謂基線矯正,是指系統從樣品所有波長的吸光度值(如核酸的A260、A280和A230原始測定值)減去指定基線矯正波長的吸光度值(如核酸常用的A340),對測試值進行修正。
Implen NanoPhotometer NP80、N60、N50微量紫外光度計的DNA測定結果報告中,系統給出了測定物質和測定方法、ng/μL濃度、消光系數、A260/A280值、A260/A230值、A230 、A260和A280測定值,并對存在異常的測定值予以警示標志。
資料顯示,國產的Nano 100、Nano 300微量紫外可見光度計的核酸樣品測試結果報告中,所列事項與前述兩款進口機型此基本一致。
NanoVolume類微量紫外可見光度計,無論是NanoDrop One、NanoDrop Eight、NanoPhotometerNP80/N60/N50、Nano300等全波長掃描功能的標準機型,還是NanoDrop Lite Plus和Nano 400這類檢測光源為230nm、260nm、280nm固定波長的精簡版型號,系統預置測定協議生成的測試報告事項,完全符合MIQE指南所規定的核酸質量評估控制要求。這樣,省去繁瑣的參數設定和測定數據手工計算,極大方便了核酸樣品質量的測評工作。
如無現成的NanoVolume紫外測定工具,如何利用普通紫外可見分光光度計進行核酸純度濃度測定?
最經濟易行的解決方案是eppendorf的UVette比色皿。
UVette比色皿同時具有兩種光程長度 ,將UVette 旋轉 90°可在10 mm 和2 mm兩種光程間切換。對于PCR、反轉錄和實時熒光定量PCR實驗,樣品經適度稀釋后,參考50μL的加樣量和采用2mm光程進行測定,或許有助于解決微量樣品測定中的基本難題。
UVette比色皿具有較好的兼容性。在標準測試光束高度8.5mm的分光光度計中,可以直接使用UVette比色皿,其操作方法即與常規比色皿測試操作一致。針對測試光束距離檢測池底部的高度為10mm、15mm的光度計,添加eppendorf提供相應比色皿適配器,將適配器-比色皿組合疊加固定后,安裝到標準光程檢測池內測試即可正常使用。
通常,綜合應用型紫外光度計儀器檢測參數設置比較繁瑣。它要求操作者對測試方法體系了然于胸,同時還要熟悉儀器本身設置方法和設定選項的涵義。
以日立UH5300的核酸測定應用為例。系統提供了核酸樣品測量功能模塊,可用于核酸樣品230 nm,260 nm,280 nm和320 nm四個測試波長吸光度測定,并根據測量吸光度和吸光度比(A260 / A280,A260 / A230)計算核酸的純度,濃度等。
開機后需完成如下步驟設置:
測量條件設置(Measurement Conditions)
樣品條件設置(Setting Sample Conditions)
測量條件設置(Setting Measurement Conditions)
核酸濃度條件設置(Setting Nucleic Acid Concentration Conditions)
檢測池6個比色皿樣品的設置(Setting 6 Cells)
對照項設置 (Setting Control Items)
打印條件設置 (Setting Printing Conditions)
保存條件設置 (Setting Condition Saving)
測量樣品溶液設置(Measuring Sample Solution)
保存和打印數據設置(Saving and Printing Data)
慶幸的是,測定參數中的核酸濃度計算因子、核酸濃度單位、核酸純度、核酸純度比值標準等關鍵設置,程序都預置有可選項,無須手工輸入。從工作界面上看,與NanoDrop One、NanoPhotometer N60 和Nano 300等生物學專用微量紫外可見光度計比,UH5300的應用程序中并未將核酸具體類型細分,Expected Ration、Nucleic Acid Conc factor與核酸類型間的對應關系,實驗者必須十分熟悉且準確無誤才行。
參考文獻
NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Rev. E)
NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.4)
Nano-300 微量分光光度計操作手冊(Version 2.0)
Eppendorf UVette Universal Adapter Use Instructions
Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual